侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

侵染辣椒的黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定及株系分析

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成 1 对引物,对侵染辣椒的黄瓜花叶病毒湖北分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析.结果表明:湖北省内不同辣椒主产区采集到的样品CP基因之间的核苷酸同源率高达98.2%～99.2%,与CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源率分别为92.1%～96.5%和72.1%～78.1%,并且和亚组Ⅰ中的ⅠB系列株系同源率更高.由此确认这4个CMV分离物属于亚组Ⅰ中的ⅠB成员.     

山西西葫芦花叶病病原鉴定与部分序列分析

利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病西葫芦进行了分子鉴定。序列测定及分析发现,具有明显花叶和斑驳症状的西葫芦受到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的侵染。为进一步明确黄瓜花叶病毒山西西葫芦分离物(CMV-XHL)的分类地位,克隆了CMV-XHL RNA3的外壳蛋白和移动蛋白基因全序列。通过序列比对分析,发现CMV-XHL CP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组ⅠB中CMV烟草分离物(CMV-SG)的相似性最高,分别为98.6%和99.5%;MP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物的相似性最高,为93.2%~94.6%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CMV-XHL与中国大多数CMV分离物聚为一类,属于CMV亚组Ⅰ中的成员。研究结果对西葫芦病毒病的防治提供一定的理论依据。     

鲁粤两省黄瓜花叶病毒辣椒分离物CP基因序列分析及亚组鉴定

从广东和山东呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到2个黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的分离物.利用RT-PCR技术克隆了病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因.核苷酸序列测定表明,CMV-GDLJ和CMV-SDLJ 2个病毒分离物CP基因序列长度为657bp,编码218个氨基酸.2个病毒分离物的CP基因序列与CMV亚组Ⅰ的6个株系CP基因序列同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ的3个株系同源性均低于80%,据此将分离物CMV-GD和CMV-TA归属于CMV亚组Ⅰ.     

辣椒CMV广州分离物的CP基因序列分析及亚组鉴定

从广州市呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到1个黄瓜花叶病毒的分离物(CMV-GZ)。利用RT-PCR技术克隆了该病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因,其序列长度为657 bp,编码218个氨基酸。对CP基因序列进行同源性比较分析,结果表明该病毒分离物的CP基因与CMV亚组Ⅰ5个株系的同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ4个株系的同源性均低于80%。据此将该分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

云南主要地区辣椒分离的黄瓜花叶病毒的亚组鉴定*

 在云南富民、砚山、邱北和南涧等云南主要辣椒产区采集了28个病毒样品，选择应用RT-PCR,Msp I以及EcoR I酶切和克隆测序等分子生物学手段对其中的7种进行检测。经过RT-PCR实验确定其病原为黄瓜花叶病毒（CMV），同时分离物的Msp I酶切图谱与CMV亚组I的酶切图谱很相似，经EcoR I酶切后也没有出现异常差异。进一步对所检测的黄瓜花叶病毒分离物的外壳蛋白基因进行克隆测序，结果表明，分离物的核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物的核苷酸序列有极高的同源性，达93%~98%; 而与亚组II株系的核苷酸序列同源性仅为77%。因此将所分离到的黄瓜花叶病毒分离物归属于黄瓜花叶病毒亚组I。     

黄瓜花叶病毒紫松果菊分离物外壳蛋白特性分析

以紫松果菊上分离的黄瓜花叶病毒2-1-2的RNA为模板,采用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应,下同)技术对2-1-2的外壳蛋白(coat prote in,CP)基因进行了克隆和序列测定。该CP基因全长657个碱基,编码218个氨基酸。其核苷酸序列和推导的氨基酸序列与亚组I代表株系Fny的同源性分别为94.5%和98.1%,与亚组II代表株系Q的同源性分别为77.7%和82.5%。对包括该分离物在内的20个CP序列与地域之间的关系进行了分析,结果表明CMV不同分离物的亚组类型与地域无明显关系。     

黄瓜花叶病毒强毒株外壳蛋白基因克隆和序列分析

在辣椒上分离到一株黄瓜花叶病毒分离物CP310，对其进行14种寄主植物生物学反应测定，发现CP310在心叶烟、克里夫兰烟等植物上表现致死症状，在番茄、烟草表现为植株明显矮化。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成引物，采用常规RT-PCR方法对其外壳蛋白基因进行扩增并克隆，序列分析结果显示：该分离物外壳蛋白基因全长657个核苷酸，编码218个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与所比较的CMV亚组I的分离物有很高的同源性，分别为91．0％～94．7％和96．0％～98．2％．与CMV亚组Ⅱ的同源性分别仅为76．6％～78．0％和76．0％～78．9％。     

菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析

以菜豆黄花叶病毒分离物、蚕豆、豌豆为试验材料,进行了菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析。结果显示,目标片段中包含819 bp的外壳蛋白序列,编码273个氨基酸。分离物的外壳蛋白基因核苷酸和推导编码蛋白质的氨基酸序列的同源性分别为98.7%~99.9%和98.9%~100.0%。与65个菜豆黄花叶病毒外壳蛋白进行序列同源性和系统进化树分析的结果表明,菜豆黄花叶病毒青海蚕豌豆分离物与云南蚕豆分离物同源性最高。外壳蛋白的序列特征揭示,NAG为菜豆黄花叶病毒中病毒的蚜传相关基序。     

甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 从山东省3地市感病的白菜和萝卜上分离到芜菁花叶病毒6个分离物，将其分别命名为TuMV-SD1、TuMV-SD2、TuMV-SD3 、TuMV-SD4、 TuMV-SD5和TuMV-SD6。利用RT-PCR克隆了这6个分离物的外壳蛋白基因，测定了它们的核苷酸序列，并进行了序列分析。结果表明，6个分离物的CP基因均为867个碱基，核苷酸序列同源性较高, 达97.0%～99.4%；它们与World-B组分离物的同源性最高，达91.8%～100%；与Brassica- Raphanus (BR) 致病型分离物的同源性次之，在89.1%～91.0%之间；与basal-B组分离物的同源性最低，仅86.0%～90.3%。基于TuMV的CP基因核苷酸序列的分子进化树显示，TuMV分离物可分为4组，本研究所分离到的6个TuMV山东分离物属于第四组，即world-B组。用分离到的6个TuMV分离物对已获得的转TuMV CP基因的抗病毒大白菜进行攻毒试验。结果表明，尽管作为转基因的CP基因与这6个分离物的CP基因只有88.2%～88.9%的同源性，但转基因大白菜对这6个分离物均具有明显抗性。     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板，采用RT-PCR技术，对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein，CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明，TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099），通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因，编码159个氨基酸；3'端的204个氨基酸为非编码区；此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098），编码218个氨基酸；此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

马铃薯X病毒贵州分离物的分子鉴定

从贵州威宁县染病马铃薯植株中分离得到马铃薯X病毒贵州分离物(PVX-GZ),采用RT-PCR扩增并克隆了该分离物的外壳蛋白基因(CP).经测序,该CP基因长714 bp,编码237个氨基酸残基,分子量25.2 ku;与19种已报道的PVX各地分离物的同源性相比,其核苷酸和氨基酸序列分别在78.6％～97.5％和84.8％～99.6％之间,其中,与两种典型的PVX X3株系(荷兰分离物X3和英国分离物UK3)的基因序列同源性达97.1％以上.结合寄主鉴别结果,判断该分离物属PVX的X3株系.     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。     

基于外壳蛋白核酸序列的中国黄瓜绿斑驳花叶病毒分离物起源分析

以直接从中国进口源性葫芦种子中提取的总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得种子上携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(CP)基因(LHP,Liaoning cucurbits seed protein ),将其克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明该CP基因(GenBank登陆号:DQ997778)由483个核苷酸组成,编码161个氨基酸.对包括该分离物在内的19个CP基因核苷酸序列进行同源性比较和系统进化树构建,并结合寄主来源及地域来源进行LHP的起源分析,结果表明黄瓜绿斑驳花叶病毒不同分离物的序列分群和进化关系与上述两个因素无明显关系.     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板，通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因，并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404，采用叶盘法转化烟草NC89，然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测，共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明，外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中；不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草，其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子鉴定

从表现花叶、畸形的加工番茄病株上获得分离物xj124,用1对ToMV CP基因引物进行RT-PCR,扩增得到了689 bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体pMD18-T中再转化到大肠杆菌TOP10。经限制酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR产物大小相同的689 bp的插入片段。cDNA全序列分析表明,所扩增出的689 bp ToMV CP基因,含1个480 bp开放阅读框架(ORF),编码160氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的ToMV CP基因。所测得的xj124分离物与国内外已报道的部分ToMV CP基因序列比较,核苷酸同源性高达84.4%~99.8%,氨基酸同源性高达98.7%~100%。因此将该分离物鉴定为番茄病毒病花叶病毒。