PEG-CaCl_2介导牛樟芝遗传转化体系的构建

为建立稳定的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)遗传转化体系,同时筛选出适宜介导牛樟芝原生质体转化的PEG-CaCl_2浓度。利用潮霉素抗性、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记和PCR扩增验证拟转化子。结果表明:新鲜的牛樟芝菌丝体在10 mg/mL溶壁酶溶液中,30℃条件下酶解4h,原生质体的获得率为3.55×105个/mL;菌丝体和原生质体在潮霉素B浓度分别为60μg/mL和40μg/mL时不能生长,最终确定筛选拟转化子的潮霉素B浓度为60μg/mL;浓度为20%~40%的PEG均可介导牛樟芝原生质体转化,且40%的PEG转化效率最高。     

PEG 介导的广东虫草原生质体遗传转化体系建立及其应用

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝体为材料,采用单因素分析方法对原生质体制备过程中酶解组合、酶解时间、酶解温度、复苏培养基及抗性标记进行筛选。同时以潮霉素抗性标记质粒 pCAMBIA1300 为转化片段,采用单因素分析方法对 PEG 介导的原生质体转化过程中亚精胺浓度、PEG 加入间隔时间、抗生素添加时间进行筛选。并以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子 CgPro1 敲除片段为目的转化片段,对转化系统进行验证。【结果】广东虫草原生质体制备的最佳组合条件为：采用含有裂解酶 + 崩溃酶的混合酶体系（1∶1）对广东虫草的菌丝体进行酶解,且酶解温度 28 ℃、酶解时间为 5.5 h 时原生质体得率最高;原生质体复苏过程中,TB3 复苏培养基对广东虫草原生质体的复苏效果最好、其次为 0.6 mol/L KCl-PDA;PEG 介导原生质体转化过程中,加入 5 mmol/L 亚精胺、PEG 加入间隔时间 10 min、原生质体复苏 3 d 后添加 250 μg/mL 潮霉素抗性标记进行筛选,转化效率最高。此外,通过建立的转化系统获得 3 个 CgPro1 敲除突变株及 3 个杂合子,表型分析结果显示,该基因参与广东虫草子实体发育过程。【结论】建立了成熟的广东虫草原生质体制备及 PEG 介导的遗传转化体系,可为今后广东虫草基因功能、蛋白定位等遗传操作研究奠定良好基础,同时为广东虫草遗传育种提供重要应用参考。     

以潮霉素B抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建

使用含裂解酶(来自Trichoderma harzianum)10mg/ml的0.8MNaCl(Ph5.8),28℃下,处理水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝8小时,获得其原生质体。采用PEG介导的方法,将含有潮霉素B抗性标记的质粒pSM565转入水稻立枯丝核菌的原生质体,并在潮霉素B浓度为30μg/ml的选择性培养基上筛选转化子,获得了5-6个转化子/μgDNA的转化频率。随机挑选8个转化子,通过PCR方法检测到其中存在潮霉素抗性基因。     

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

为了构建限制性内切酶介导的整合(REMI)技术介导的红曲霉(Monascus anka)遗传转化系统,以潮霉素B作为抗性筛选标记,pBC-Hygro、pCB1003、pAN7-1作为转化质粒,采用REMI技术转化红曲霉.结果表明,用REMI技术介导红曲霉转化时,质粒pBC-Hygro和pCB1003适合于红曲霉的转化.环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别;在用REMI技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化;原生质体浓度为1×107～1×108个/mL时,每微克质粒可获得的潮霉素B抗性转化子为2 800～3 200个;HindⅢ介导转化时的最佳酶用量为105～120 U;在质粒用量为8μg/100 μL时转化率最高.     

人参尖镰孢菌原生质体制备条件优化及绿色荧光蛋白转化

为人参根腐病菌的侵染及防治提供可视化的检测和分析手段,通过摸索分生孢子最适萌发时间、酶解液组成、酶解温度、摇床转数及渗透压稳定剂种类,研究人参根腐病菌-尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)原生质体制备技术.结果 表明:将人参尖镰孢菌野生型菌株0083分生孢子在YEPD培养基中培养11h,酶解温度37℃、摇床转数180 r/min,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaC1的条件下,酶解液(崩溃酶、溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶质量浓度分别为0.01,0.03,0.02,0.005 g/mL)酶解0.25 g菌丝时,收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放,共获得2.8× 107/mL原生质体.用聚乙二醇PEG介导外源DNA随机插入的方法,成功获得具有绿色荧光信号和潮霉素B筛选标记的转化子,转化效率(以单位质量的DNA的转化子数计)为1400/mg.选取转化子FOG1菌株经过6代继代培养后,菌落形态、产孢量和绿色荧光蛋白的表达与菌株0083无明显差异.因此,利用聚乙二醇(PEG)为媒介的遗传转化体系是稳定高效的遗传转化体系.     

PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化

为建立PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola的遗传转化体系,以果生刺盘孢SQ06-E的幼嫩菌丝为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素标记的质粒pCB1003转入果生刺盘孢菌丝的原生质体中;对获得的转化子进行遗传稳定性检测、PCR检测和Southern杂交分析。试验获得果生刺盘孢的最优转化体系为:密度为1×106 mL-1分生孢子在M3S培养基中,28℃、200r/min震荡培养8h;过滤收集菌丝,在质量浓度为0.25g/mL崩溃酶+0.05g/mL溶壁酶的10mL酶解液中加入0.5g湿菌体酶解3h;整个试验的渗透压稳定剂为0.8mol/L KCl。试验共得到76个转化子,转化率为1μg DNA获得3~4个转化子。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析都表明hph基因已整合入果生刺盘孢的基因组中。所有转化子在PDA培养基上继代5次后仍能正常生长,说明外源基因hph能在果生刺盘孢中稳定遗传。     

草菇原生质体制备、再生及转化研究

用酶解法对草菇原生质体制备及再生条件进行了研究.结果表明: 液体静置培养4 d的菌丝,以0.6 mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂,溶壁酶质量浓度15 mg/mL,34 ℃下酶解3 h,原生质体制备率最高;草菇原生质体预培养16 h后涂布在再生培养基上,再生率最高.同时,采用PEG法将潮霉素抗性基因转入草菇的原生质体中,经过抗性筛选,得到了具有潮霉素抗性的草菇转化子.     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

高效银耳芽孢遗传转化体系的建立

 【目的】建立PEG介导的高效银耳（Tremella fuciformis）芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1（含有构巢曲霉gpd-An 启动子和潮霉素抗性基因hph）和pLg-hph（含香菇gpd-Le启动子和hph基因）转化进银耳芽孢的细胞中；采用夹层法在含50 µg•ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子，之后转接于潮霉素含量为100 µg•ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高；pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证，结果表明hph基因能有效整合进银耳芽孢的基因组中，其转化率为110个/µg DNA。而pAN7-1转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证，结果表明只有部分转化子基因组中整合了hph基因，其转化率只有9个/µg DNA。银耳芽孢转化子在PDSA培养基中继代5次后仍检测到hph基因的存在，表明外源基因hph能在银耳芽孢继代中稳定遗传。【结论】25%的PEG4000能高效介导银耳原生质体的转化；香菇gpd-Le启动子是银耳芽孢表达外源hph基因的强启动子；外源hph基因能够在银耳芽孢继代培养中稳定遗传。     

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征，采用问卷调查的形式，就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示，生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚，有着极大的开发空间，指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主，开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用，尤其是要注重媒体的宣传．     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

黑豆不同部分馏油的体外抗氧化性比较

[目的]通过体外抗氧化体系比较黑豆不同部分馏油抗氧化性活性。[方法]通过正交试验优化索氏提取黑豆馏油的最佳工艺,提取黑豆不同部分馏油;研究黑豆不同部分馏油对羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力。[结果]在样品浓度为1.0 mg/mL时,黑豆不同部分馏油对·OH的清除率分别为全豆馏油83.9%、豆黄(黑豆去皮部分)馏油64.8%、豆皮馏油17.3%,对DPPH·的清除率分别为全豆馏油41.3%、豆黄馏油33.2%、豆皮馏油77.9%。[结论]黑豆不同部分馏油均具有较好的抗氧化性,是良好的天然抗氧化剂。黑豆不同部分馏油对·OH的清除能力从大到小依次为全豆馏油、豆黄馏油、豆皮馏油,对DPPH·的清除能力从大到小依次为豆皮馏油、全豆馏油、豆黄馏油。     

干旱对合丰42不同部位叶片发育的影响

在垄作、密植两种栽培方式的条件下，研究干旱对大豆不同部位叶片发育的影响。结果表明：无论垄作还是密植，干旱严重影响大豆叶片不同部位叶绿素含量、叶面积及周长的大小、不同部位叶长、叶宽及比值、叶片形状因子等。影响整个植株的生长发育，进而影响作物产量。     

参与式农业基地建设行动方案设计

为了编制实用性强的基地建设行动方案，首先，确定参与式发展的主体，搭建一个“决策框架”；其次，针对行动目标，提出不同参与主体，如管理者、农民、消费者等团队与个人的目标及行动内容；最后，工作应向重塑伙伴式合作关系，挖掘农民自我发展潜力，完成三大角色的转换，打造农业基地文化等方向推进。     

切花菊耐热性鉴定方法研究

以8个切花菊品种为材料,通过对离体叶片进行50℃高温胁迫后,采用电导法、电阻抗图谱法测定电导率、电阻,并对大田栽培植株进行田间高温胁迫试验,比较品种间的耐热性。结果表明:电导法测得的50℃直接相对电导率、修正相对电导率和电阻抗图谱法测得的胞外电阻在品种间有明显差异,但与田间高温胁迫法测定的热害指数不完全一致。电导法和电阻抗图谱法都可以作为测定切花菊耐热性的方法,但需要结合田间耐热性观察。     

姬松茸碳源利用规律的研究

试验采用麦秸培养基,系统研究了姬松茸在生长期间对碳源的利用规律。结果表明,姬松茸降解的有机物质绝大部分被菌体的呼吸过程消耗掉,绝对生物学效率较低;在菌丝生长阶段,木质素的降解速率大于纤维素和半纤维素,这对纤维素和半纤维素的降解十分有利;非木质纤维素组分在菌丝生长阶段被主要利用,而木质纤维素则是子实体生长阶段的主要碳源。且就整个栽培过程而言,姬松茸生长发育所需要的79.86%的碳源来自木质纤维素。