CaKR1上游启动子分离及其表达分析

运用基因组步移技术分离获得了CaKR1基因上游-1594 bp的启动子序列,命名为CaKR1p,发现其中含有SA、ABA、低温等信号应答原件以及其它诸如W盒等应答逆境胁迫的调控原件。进一步构建CaKR1p与GUS报告基因融合的植物表达载体,获得了烟草转基因植株及其相应的T1代株系,利用T1代转基因株系分析了CaKR1p在几种外源激素处理下的GUS基因的表达,结果表明外源激素SA、JA和ABA的诱导处理均可激活该启动子下游报告基因GUS的表达,说明CaKR1的表达和作用受到SA、ABA以及JA等信号通路调节。     

毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能

为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。     

拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析

通过特异PCR扩增技术,以拟南芥基因组DNA为模板,克隆了rd29A基因上游1 600 bp的胁迫诱导型启动子序列。将此1 600 bp的调控序列与GUS基因连接构建植物表达载体pBI101-rd29A-GUS,并用农杆菌介导法转基因拟南芥。定量PCR结果显示,干旱胁迫下转基因纯合株系中rd29A显著上调表达。GUS组织化学染色及GUS定量分析结果表明,在ABA、甘露醇和NaCl等胁迫处理下,GUS活性增强,尤其是ABA胁迫处理。说明rd29A启动子可以增强逆境下GUS基因的表达,可作为一种诱导型启动子应用于提高作物抗逆性的基因工程研究中。     

水稻WRKY19基因启动子功能研究初报

利用已获得的水稻WRKY19基因启动子(OsW19p::GUS)的转基因植株进行研究,分析了OsW19p在T1代苗期时的诱导表达特性,GUS荧光测定结果表明:OsW19p的表达可被ABA(100μmol/L)、SA(500μmol/L)、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理增强;被2,4-D(1μmol/L)、NaCl(200mmol/L)和PEG4000(25%)处理抑制;IAA(5μmol/L)、MeJA(100μmol/L)和紫外线照射处理对OsW19p的表达几乎没有影响。OsW19p在转基因植株根中的表达水平高于35s,但在叶片中低于35s。OsW19p在转基因水稻扬花期茎部中表达水平最高,其次是花、叶鞘和叶片,在根部表达水平最低。     

水稻启动子OsN1p的克隆与功能分析

将OsN1基因上游881 bp启动子(OsN1p)序列取代pBI121中gus基因上游的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1p,经农杆菌介导转化水稻品种‘日本晴’,获得转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,由该启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中较低水平地表达;稻瘟病菌接种转基因植株24 h后,GUS活性为未接种前的4.2倍;5 mmol.L-1水杨酸(SA)和0.5 mmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)分别喷施转基因植株叶面6 h后,GUS活性分别为处理前的5.9和2.4倍。表明,OsN1p启动子具有启动活性,同时明显具有受稻瘟病菌、SA和MeJA诱导表达的特性。     

玉米虫害诱导基因启动子在拟南芥中的活性分析

植物在感知到虫害信号后会经过复杂的转录调控,开启防御基因的表达。这一过程大多受到茉莉酸信号途径的调控,现有的相关研究主要集中在双子叶模式植物拟南芥中,在单子叶植物玉米中是否具有相似的转录调控模式目前尚不清楚。为了探索这一问题,从被玉米螟咬食和150 μmol/L JA处理12 h的RNAseq玉米文库中获得两个同时受诱导的基因,Zm281和ZmPal,重点对其启动子的诱导活性进行了分析。结果表明,这两个玉米启动子在未受JA处理的拟南芥中不能启动GUS报告基因的表达,但是在茉莉酸诱导后GUS报告基因受到强烈诱导,且在各组织器官中均有表达。该结果表明受虫咬后诱导表达的基因同时受JA的诱导,可为研究JA诱导虫害应答的分子机理奠定基础。     

金针菇JA/SA信号通路基因鉴定及其对外源JA/SA应答

本研究鉴定了金针菇茉莉酸(JA)信号通路的4个关键基因:COI1、PDF1.2、MYC2-1、MYC2-2与水杨酸(SA)信号通路的4个关键基因:PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2。NBT染色法和荧光定量结果表明,金针菇JA/SA信号通路可应答外源JA/SA,50μmol·L~(-1)外源JA和500μmol·L~(-1)外源SA处理金针菇菌丝12h可显著提高JA/SA信号通路基因的转录水平,基因PDF1.2响应JA诱导最明显,可作为JA信号通路标记基因;JA/SA信号转导途径间存在协同或拮抗作用:SA信号转导通路中NPR1蛋白对JA信号转导通路中PDF1.2基因表达有抑制作用,外源JA/SA的相对浓度决定其作用的强弱。     

水稻强分蘖基因MT1启动子的克隆及与GUS、GFP融合基因的构建

[目的]研究MT1启动子的功能。[方法]通过转基因植株中MT1启动子指导外源基因GUS及GFP的表达。[结果]研究克隆了MT1启动子,并将启动子区与报告基因GUS及GFP的编码区融合。[结论]利用MT1启动子与GUS、GFP构建融合基因,能够用于研究启动子功能。     

水稻OsN1基因5’端启动子不同区域序列分析

为了研究水稻OsN1基因启动子(OsN1p)的表达调控机理,用OsN1基因ATG(ATG中的A为0)上游-1 089 bp、-881 bp、-489 bp和-245 bp的启动子序列分别取代pBI121中的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1.1p、pBIN0.9p、pBIN0.5p和pBIN0.2p。将这些表达载体经农杆菌介导转化水稻日本晴,获得转基因植株。对启动子的表达特点和启动活性进行了分析,结果表明,由-1 089 bp启动子、-881 bp启动子和-489 bp启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中表达,-245 bp启动子不能驱动gus基因在愈伤组织中表达,说明启动子OsN1p具有启动活性的最小启动序列为ATG上游的-489 bp;-489 bp启动子驱动的gus基因在转基因植株根中表达,在根冠不表达;用5 mmol/L水杨酸(SA)喷施转基因植株叶片后,GUS定量分析结果表明转基因植株的GUS活性增高,转-881bp启动子植株的GUS活性比转-1 089 bp启动子植株的活性高。可见,启动子OsN1p具有组织特异性表达和受SA诱导表达的特性。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析（摘要）

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新的糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30d的植株中,转-220～0bp片段的GUS染色最少,转-524～0bp及-468～0bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0bp和-468～0bp2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1150～0、-800～0、-220～0bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（Southern杂交结果）;-800～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1150～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220bp存在提高启动子活性调控元件,-1150～-524bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

根结线虫诱导巨型细胞形成关键启动子的定位

为了找到根结线虫诱导的烟草根结内特异性强启动的启动子和了解巨型细胞被诱导形成的分子机理,用无启动子的报告基因(GUS)及旁边的Ds转座子,分离烟草根结内巨型细胞特意启动子.将p13DGUTs转烟草叶片,获得了转基因植株.通过根结线虫感染盆载转基因烟草后,分别检测根系、叶的报告基因的表达情况.结果显示,从转基因植株中筛选到只在根结巨型细胞内表达的转基因植株.     

烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切

【目的】烟草（Nicotiana tabacum L.）碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体（nic1和nic2）中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1（nicotine- synthesis related splicing element 1）与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯（ET）和茉莉酸（JA）处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。     

GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成

该研究成功地将从刺槐 (Robiniapseudoacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的GRP1 8启动子 ,分别与GUS报告基因及从毛白杨 (Populustomentosa)中克隆的香豆酸连接酶 (4CL1)基因连接构建成GRP1 8 GUS和GRP1 8 anti 4CL1融合基因 ,转基因于烟草植物 .经组织化学检测分析 ,GUS基因成功地由GRP1 8启动子驱动定位于形成层表达 ;融合基因GRP1 8 anti 4CL1的表达明显地改变了转基因烟草植株的木质素和纤维素的含量和比例 .转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了 13 7% ,而转基因植株的纤维素含量较对照升高了 15 6 % .     

1个新水稻组成型启动子的克隆与功能鉴定

根据基因芯片数据库和RT-PCR验证得到1个高活性的水稻组成型表达基因(TIGR Locus:LOC-Os07g34589),用PCR技术从籼稻品种明恢63基因组中克隆得到其上游启动子PSUI1,长度为1 941bp;将其与β-glucuronidase(GUS)报告基因融合构建植物表达载体DX2181b-PSUI1,利用玉米Ubiquitin启动子融合GUS报告基因构建表达载体DX2181b-PUbi作为对照,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将DX2181b-PSUI1和DX2181b-PUbi转化粳稻品种中花11。组织化学染色表明,含DX2181b-PSUI1的转基因植株中,GUS基因在幼苗期叶片、叶鞘、根,抽穗期叶片、叶鞘、茎秆、颖壳、雄蕊和成熟期的叶片、叶鞘、茎秆、胚、胚乳中均有表达,说明PSUI1为组成型启动子。对GUS表达活性进行定量分析表明,PSUI1启动子的活性约为玉米Ubiquitin启动子活性的1/3～1/2,但是PSUI1表现出了更好的表达稳定性。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16 h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30 d的植株中,转-220～0 bp片段的GUS染色最少,转-524～0 bp及-468～0 bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0 bp和-468～0 bp 2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1 150～0、-800～0、-220～0 bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（South-ern杂交结果）;-800～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1 150～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220 bp存在提高启动子活性调控元件,-1 150～-524 bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT)启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7～10.9倍。结果表明MPBQMT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

Specific Expression of Maize SBEIIb Promoter Mediated by Different Promoter Region in Transgenic Tobacco Plants

Starch branching enzyme （SBE） catalyzes the biosynthesis of amylopectin. We described the isolation and characterization of SBEIIb promoter and their expression patterns in transgenic tobacco. Using the genomic DNA of maize cultivar Lunuo 1 as template, the SBEIIb promoter was isolated by PCR and was cloned into pMD18-T vector. To study SEBIIb gene regulation at the cellular level, SBEIIb promoter was fused to the ~-glucuronidase （GUS） report gene. The results of the fluorometric GUS assays indicate that the sbeⅡb-GUS fusion directed a seed-specific expression. Four series of constructs were made with the promoter and the GUS reporter gene to investigate the cis-acting analysis, showing that the four different constructs all can drive expression of the GUS gene in seed plumule and cotyledon and the GUS activity was apparently decreased with the progressive loss of promoter 5＇ end.