基因枪法获得Phs-r转基因小麦植株的研究

实验以普通小麦豫麦18-64品种为供试材料,采用基因枪法对报告基因(Bar基因)和目的基因(PHS-r基因)两个重组质粒进行了共转化,获得了再生植株,并对转化植株进行了检测。结果表明:以预培养15d的幼胚愈伤组织作为受体材料其转化频率明显高于当天剥取和预培养3～4d的幼胚;在基因枪轰击前6h和轰击后18h,用0.5moL/L的甘露醇进行渗透处理,其转化频率会有明显的提高;实验通过基因枪转化与再生培养,共获得了12株再生植株,PPT检测且均表现出抗性,其中6株经PCR检测呈阳性,表明PHS-r基因已整合到小麦基因组中并正常表达。     

基因枪轰击法将蜘蛛丝蛋白基因(ADF3)转入海岛棉的研究

用海岛棉茎尖作为基因枪转化的靶材料,建立了可重复的海岛棉转化系统。将海岛棉茎尖分生组织经过3～6周的诱导、继代培养生长后,可以形成足够量的再生植株。用含有Npt-Ⅱ基因和蜘蛛丝蛋白基因的质粒轰击新疆海岛棉4个品种茎尖分生组织,在含有70～100mg/l卡那霉素的培养基上筛选、预再生、再生及生根培养,获得的24株抗卡那霉素转基因再生植株。所获得的转基因植株经卡那霉素筛选,再生植株总DNA提取,Southern点杂交分子检测,初步证明有2株转化植株目的基因已整合到海岛棉基因组中,同时也已得到种子。研究为通过植物基因工程的方法以期改良棉花纤维品质提供了一条新的途径。     

基因枪介导大麦基因转化体系的建立

为了进一步提高基因枪转化效率，研究建立了以澳大利亚品种Franklin幼胚为受体的高效基因枪介导转化体系。结果表明，经愈伤组织诱导、筛选培养，从519块愈伤组织中获得16株再生苗，植株再生率高达3．0％。对长势良好的9株再生苗除草剂抗性检测和目的基因的PCR、PCR-Southern检测证实7株为转基因植株，并经过对外源基因(TrxS)表达活性检测表明，转基因大麦中Trxh的活性是CK的3．3倍，为基因枪高效转化提供了成功的证据。     

基因枪介导小麦基因转化体系的建立

以豫麦18幼胚为受体，建立高效基因枪介导转化体系，经除草剂抗性和对目的基因的PCR、PCR—Southern检测，获得了20株转基因植株，转化率高达3．7％，为基因枪高效介导提供了成功的证据。     

转GhGST基因的棉花植株的获得

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)受黄萎病菌诱导表达,对黄萎病具有抗性。为明确该基因在棉花中抗黄萎病功能,本研究在前期工作基础上,以陆地棉Coker312为受体,利用农杆菌介导的茎尖转化法对GhGST基因进行遗传转化,共获得132株卡那霉素抗性植株,利用PCR检测以及胶回收测序进一步确定了11株稳定的转基因阳性棉植株。转基因植株的获得为后续GhGST基因功能研究及棉花新品种培育提供了基础材料。     

将IL-2基因构建到叶绿体转化载体并转入烟草

以人白细胞介素2(IL-2)基因为目的基因,烟草accD和ORF184同源序列为侧翼引导序列构建成烟草叶绿体转化载体pAIL。以大烟草NC89为转化受体,通过基因枪方法对烟草叶片进行轰击转化。轰击参数为:每枪0.6μm的金粉300~500μg,轰击距离6 cm,真空度9.48×104Pa。在500 mg/L的壮观霉素筛选压下,经约30 d的筛选分化,逐渐产生绿色的抗壮观霉素芽或愈伤,目前已获得31株(丛)抗性芽及8块抗性愈伤。用IL-2基因的PCR引物对4株较大的小苗进行检测,初步证明3株为转基因植株。     

基因枪导入法培育抗虫水稻

以含潮霉素抗性基因，GUS基因和雪花莲凝集素（GNA）基因的pWRG1515和pRSSGNA1为供体DNA，利用基因枪法转化上农香糯成熟胚诱导的愈伤组织，经抗性培养基筛选，从轰击的135块愈伤组织中得5株转 基因植株，GUS检测和PCR分析表明，外源基因已转入并整合到水稻基因组DNA上。     

微弹轰击小麦幼胚愈伤组织的影响因素研究

【目的】优化小麦基因枪转化技术体系,为提高小麦基因枪转化效率提供参考。【方法】以小偃22为材料,采用基因枪法分析小麦幼胚愈伤组织诱导时间、微弹轰击金粉用量及筛选分化培养基类型对基因枪遗传转化频率的影响,并对转化植株进行了检测。【结果】在相同条件下,小麦幼胚经过9d的愈伤组织诱导时再生植株率最高,达到4.24%;同一条件下,金粉用量为60μg/枪的再生植株率最高,达到3.90%;使用1/2MS培养基添加NAA1.0mg/L和KT 1.0mg/L进行转化细胞筛选与分化的效果最好,再生植株率为3.72%;对转化抗性再生植株的特异PCR检测表明,目的基因已整合到小麦染色体组中。【结论】小麦幼胚通过9d的愈伤组织诱导,基因枪轰击金粉用量为60μg/枪,使用筛选分化培养基1/2MS+KT 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+双丙氨膦2.0mg/L+蔗糖30g/L+Ag 5.0g/L进行转化细胞的筛选与分化,可获得较高的抗性再生植株率。     

农杆菌介导多年生黑麦草转化体系的建立

以胚性愈伤组织系,作为转化受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,将报告基因gus和抗除草剂基因bar 成功转入多年生黑麦草。共计获得52株T0代抗性植株。利用PCR方法对转基因植株的bar基因进行扩增, 确定阳性株系27株。对阳性植株叶片进行GUS染色,有15株叶片呈现较强的蓝色。对再生植株和野生型 植株叶片喷施5‰的除草剂Basta溶液,GUS阳性的植株全部表现为Basta抗性。以上结果表明,以黑麦草 成熟胚胚性愈伤组织为受体,通过优化农杆菌介导的黑麦草遗传转化体系,初步建立了多年生黑麦草的 转基因平台,这对黑麦草的遗传改良具有重要的意义。     

基因枪法介导的魔芋遗传转化研究

利用基因枪轰击法建立了魔芋的遗传转化体系。试验结果表明，氦气压力／轰击距离以7．58 GPa／9cm最适。在轰击前4 h和轰击后16 h用附加有0．4 mol／L甘露醇的MS培养基进行高渗处理、轰击后恢复培养6～7 d，有利于减少逆境伤害，增加转化成功的几率。早期选用1 mg／L Basta作为选择压，而后期的筛选使用2 mg／L较高浓度的Basta可以获得真正的转化子。对获得的91株抗性植株进行了PCR检测，结果显示21株呈阳性，表明PAT基因和AGPS1反义基因均已整合进魔芋基因组。     

花粉管介导的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白转基因棉花的筛选

利用新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因进行遗传转化是培育新疆棉花抗寒品种的新途径。研究采用RT-PCR结合RACE技术从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microdera puntipennis dzungarica)中克隆获得抗冻蛋白(Antifreeze protein)基因MpAFP149。将MpAFP149克隆至pBI121上,获得重组质粒后采用电转化法将重组质粒转入农杆菌EHA105内,PCR筛选鉴定重组子,并测序确定抗冻蛋白植物表达载体构建正确。将pBI121-MpAFP通过田间的花粉管导入技术转化棉花,收取转化的棉花种子,经检测证明在转化10 000朵花中,卡那霉素抗性筛选出13株,PCR检测有2株阳性植株。实验结果为进一步开展抗冻蛋白基因转化棉花的研究奠定了基础。     

子房注射法获得转基因抗虫棉植株研究

采用子房注射法将构建在植物表达载体ｐＢＩ１２１．１上的Ｂｔ杀虫基因导入棉花品种石远３２１、中植３７２、８２２和辽棉９００１中,获得８株转基因植株。经温室抗虫性鉴定,８株转基因植株对棉铃虫都表现出较好的抗性。同时对这８棵株叶片进行的ＰＣＲ检测结果证明Ｂｔ基因已经整合进植物基因组中。     

Selection of Homozygous Cotton Lines Transformed with Two Insect-Resistant Genes

A plant expression vector containing a chimeric Bt29K gene coding for the activated Cry1Ac protein and the arrowhead proteinase inhibitior gene API-B were introduced into the cotton cultivar Jihe321 mediated by Agrobactertium tumefaciens. Based on the results of kanamycin resistant testing, PCR detection for both foreign genes and insect bioassay using Heliethis armigera, nine transgenic homozygous cotton lines with insect-resistance of more than 90% and better agronomic traits were bred through six generations from the original transgenic plants. Results from insect bioassay and sequence analysis of the PCR products of plants from some homozygous lines indicated that the chimeric Bt29K gene was stably inherited in these transgenic cotton lines. The main agronomic characters of these homozygous cotton lines, such as boll productivity and fibre strength, were better than that of the original cotton cv. Jihe321.     

棉蚜ATP合成酶基因AgoATPb的克隆与表达

为确定棉蚜(Aphis gossypii)ATP合成酶B亚基基因在棉蚜不同组织和日龄,以及取食不同植物的表达情况,以棉蚜为研究对象,采用RT-PCR和RACE技术获得AgoATPb的全长cDNA序列,通过Expasy、SignalP-4.0 Server等在线工具对其进行了生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技术研究了该基因在棉蚜不同组织和不同日龄,以及在不同植物上取食的表达水平。结果表明,棉蚜AgoATPb基因全长cDNA序列为1 247 bp,开放阅读框(ORF)长度为822 bp,编码274个氨基酸,5'端非编码区长128 bp,3'端非编码区长297 bp,理论分子量为31.40 ku,等电点为8.95,无信号肽和跨膜区域。氨基酸序列比对结果表明,棉蚜AgoATPb与其他昆虫同源基因编码蛋白的氨基酸序列一致性为47%~99%。除了不在胚胎表达外,AgoATPb基因在棉蚜其他日龄和不同组织均有表达,且在不同日龄间与不同组织表达水平存在显著差异。取食不同植物后棉蚜AgoATPb基因表达水平存在显著差异,取食棉花表达水平最高,其次是黄瓜和西葫芦,取食甜瓜表达水平最低,推测该基因可能与棉蚜适应寄主植物有关。     

亲环素基因GhCYP1在陆地棉中的过量表达及耐盐性分析

通过农杆菌介导法将亲环素基因GhCYP1导入陆地棉棉花栽培品种中棉35中,经过卡那霉素抗性选择、PCR检测和系统选育获得5个不同转基因纯合系。在温室盆栽条件下,于3片真叶期对转基因棉花纯合系和非转基因对照进行200 mmol/L NaCl胁迫处理20 d。结果表明,转GhCYP1基因棉花株系比对照长势强,株高比对照提高2~5 cm,地上部分单株鲜质量比对照增加7.1%~12.4%,抗氧化物酶SOD,POD,CAT等的活性以及叶绿素含量显著高于对照。说明过量表达GhCYP1基因提高了陆地棉对盐碱的抗性。     

IPT基因遗传转化谷秆两用稻的研究

采用农杆菌介导的方法,将嵌合基因PSAG12-IPT导入谷秆两用稻201幼胚诱导的胚性愈伤组织中,经潮霉素筛选,抗性愈伤分化成苗,共获得46个抗性愈伤克隆,126株转基因植株.对这些植株进行PCR检测和GUS染色分析,确定其中80株为阳性植株.     

转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

 用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。     

双价抗虫转基因棉花研究

 构建了携带人工合成的GFM CryIA杀虫基因和经过修饰的CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC。采用花粉管通道法,将pGBI121S4ABC转入到石远321、中棉所19号、3517和541中国棉花生产品种中,首次获得了双价转基因抗虫棉株系。叶片室内抗虫生物学鉴定表明,抗性好的株系棉铃虫幼虫校正死亡率大于96%;经分子检测,证实了双价杀虫基因在棉花基因组中的整合与表达。     

辽棉19号转化耐盐基因AlNHX1的研究

为提高辽宁棉花品种的耐盐性,利用农杆菌介导上胚轴外植体转化法,将来源于盐生植物獐茅的Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)导入棉花辽棉19号中,分析影响棉花上胚轴外植体农杆菌转化的几个重要因素,建立并优化了该品种的转化体系,结果表明:1)农杆菌侵染的最佳时间为90s,共培养过程中乙酰丁香酮最适浓度为100 mg/L,筛选培养基中潮霉素最适浓度为30 mg/L,生根培养基中吲哚乙酸IBA的最适浓度为10mg/L;2)对转化植株进行PCR检测,表明耐盐基因AlNHX1已导入辽棉19号中;3)在盐胁迫下,转基因植株的电导率,渗透势都显著低于未转化植株。结果表明,通过筛选并优化转化体系,辽棉19号品种的耐盐性有较明显的提升,为沿海滩涂地区种植棉花提供了一定的参考。     

Introduction of rol Genes into Cotton (Gossypium hirsutum L.) Genome and Effects of Transgene Expression on the Plant Development

The rol genes cloned from Agrobacterium rhizogenes were transferred to the cotton genome via Agrobacterium-mediated transformation. Molecular analyses and developmental identification of the putative transgenic plants were carried out by means of PCR, Southern blotting and field characterization. The results showed that the expression of rol genes greatly increased the rooting ability of the transgenic plants, and changed the plant development. Highly male-sterile plants with strong apical dominance and fertile plants with short internodes, stunted growth and improved economic characteristics were segregated from the T1 transgenic lines of wild rol B gene and the rol B gene driven by 35S promoter. The transgenic lines of rol ABC construct usually had normal boll setting and slow growth. Therefore we concluded that the rol genes, modified in suitable ways,could be used to create new cotton varieties with some highly valuable characteristics.