苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株。[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL。采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定。[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株。[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础。     

豆科植物-根瘤菌识别的分子机制及其共生多样性与生态环境的关系

豆科植物—根瘤菌的相互识别属亲和性(阴性)识别系统,吸附的专化性取决于分子识别,参与分子识别的物质包括豆科植物凝集素、类黄酮和根瘤菌表面的胞外多糖、荚膜多糖及脂多糖。介绍了这些识别子的研究进展及豆科植物—根瘤菌相互识别的分子机制,并揭示豆科植物—根瘤菌共生多样性与生态环境的关系。     

农杆菌介导rolC基因转化烟草植株的研究

通过根癌农杆菌介导手段，将来自发根农杆菌的rolC基因转化到烟草（Nicotiana tabacum)植株的基因组，并借助GUS组织化学法，PCR扩增法和Southen杂交进行了鉴定证实。 rolC基因改变转基因烟草植株某些性状的特点，如植株高变矮，花冠变小，雄蕊 变短等，还发现rolC基因具有延迟转基因烟草植株花期的作用。     

菊芋凝集素基因转入烟草的研究

菊芋凝集素是一种对同翅目、鞘翅目、鳞翅目害虫有抗、杀作用的蛋白质 ,通过遗传工程的手段 ,将菊芋凝集素基因置于CaMV35S组成型启动子和T nos终止子的控制下 ,构建了用于转化烟草的植物表达载体 ;在根癌农杆菌介导下转化烟草 ;经PCR检测证明获得了转基因烟草     

转基因水稻的抗虫性初探

用基因枪技术将雪 莲外源凝集素基因和大豆胰蛋白酶抑制剂基因，分别转化到水稻的胚性愈伤组织，经过筛选再生分别得到转基因Ⅰ和转基因Ⅱ植株。     

蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

 【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号：DQ352145),该基因全长871 bp, ORF框长558 bp, 编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。     

反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成

[目的]研究木质素的生物合成及调控,降低木质素的含量或改变其组分。[方法]用农杆菌介导法将苎麻反义CCoAOMT基因导入烟草,采用PCR及Southern印迹对获得的转基因植株进行分子检测,并测定移栽3个月转基因植株Klason木质素及纤维素含量。[结果]转基因烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低了16.8%,纤维素平均含量升高了15.2%,并且植株生长正常。[结论]抑制植物CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成的有效途径。     

超表达小麦基因TaSOD1.1和TaSOD1.2对烟草耐低温能力的影响

 【目的】研究超表达小麦基因TaSOD1.1和TaSOD1.2对烟草耐低温能力的影响。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化技术，获得融合靶基因的转基因烟草植株;通过比较低温处理后对照和转基因系的表型和生理指标，鉴定超表达靶基因对烟草耐低温能力的调控效应。【结果】以分子检测鉴定的插入单拷贝基因的4个转基因系和对照为材料，低温处理后超表达外源基因的转基因植株叶片失绿缓慢，叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性明显增加，反映细胞膜质过氧化程度的丙二醛（MDA）含量明显下降;叶片叶绿素a、b和类胡萝卜素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均明显提高。【结论】超表达小麦TaSOD1.1和TaSOD1.2的烟草植株，具有增强SOD活性、明显缓解低温造成的细胞膜质过氧化程度、改善低温胁迫下植株的生理功能，可进而改善植株抵御低温胁迫的能力。     

我国野生燕山葡萄VyUSP1基因抗逆功能的初步验证

研究我国野生葡萄燕山葡萄(Vitis yeshanesis‘Yanshan’)VyUSP1基因在转基因烟草不同逆境下的表达情况，选择从供试材料中克隆所获得的VyUSP1基因，利用重组法构建其载体，并用农杆菌介质为导体转化转基因烟草植株，获得USP转基因烟草植株，然后对转基因烟草植株进行不同逆境处理，并对该基因进行初步的功能研究。结果表明，在不同的逆境条件下，USP转基因烟草均具有一定的抗干旱能力，但是不具备抗寒能力。较高浓度NaCl、甘露醇、PEG-6000以及低温处理会抑制转基因烟草种子的萌发。而在不同浓度NaCl、甘露醇处理下，转基因烟草植株幼苗均比野生型(WT)植株幼苗的表现要好；不同浓度PEG-6000处理对转基因烟草幼苗生长的影响并不明显；但在低温处理条件下，转基因烟草植株幼苗全部死亡。植物在受到外界胁迫时VyUSP1基因的表达会上调，蛋白活性被激活之后，有助于提高植物的抗逆性，增强其环境的适应性，因此USP对逆境胁迫存在一定的抗性。     

毛白杨TIR-NBS-LRR基因转化烟草的研究

该文采用农杆菌介导法将从毛白杨中克隆得到的TIR-NBS-LRR抗病基因（PtDRG01）导入烟草中，经抗生素筛选和PCR分子检测，获得了一批阳性转化植株。进而对这些阳性转化植株进行烟草花叶病毒接种实验，从表型观察结果发现，在接种病毒1周和6周后，转基因烟草株系TG-11的发病程度明显低于非转基因烟草。荧光定量分析结果显示，转基因烟草株系TG-11叶片中的烟草花叶病毒(TMV)数量显著低于非转基因植株，且该转基因株系中的PtDRG01基因转录水平显著高于非转基因植株。这些结果表明，毛白杨PtDRG01基因具有明显的抗病功能，其高效表达能够显著提高烟草的抗TMV能力。该文通过对烟草的遗传转化与病毒接种实验，鉴定了PtDRG01基因的功能，可为其他TIR-NBS-LRR基因的功能鉴定提供参考。      

根际解钾菌的筛选及其对烟草钾素吸收的影响

为提高烟叶钾含量，减少化肥施用量，采用选择性培养基结合烟草凝集素的筛选方法从烟草根际筛选高效解钾菌株，并分别通过盆栽试验和田间试验评估菌株对促进烟草生长及钾素吸收的效果。共筛选获得6株烟草根际解钾菌株，其中假单胞菌(Pseudomonas sp.)LK26菌株具有较优良的促生长特性。盆栽试验表明LK26菌株可显著提高烟草叶片和根系重量，提高烟草根际土壤钾含量及烟叶钾含量。田间试验表明，与施加减钾肥20%、未接种菌液及施全肥、未接种菌液的烟草植株相比，接种LK26菌株的烟草植株其根际土壤钾含量分别提高27.71%和10.25%；其下叶、中叶和上叶钾含量分别提高17.80%和5.30%，40.59% 和24.48% 以及15.69% 和5.36%。该菌株是一株潜在的烟草用生物钾肥优良菌株，具有进一步研究和应用潜力。     

不同根瘤菌比例·营养液及用量在菜豆上的应用效果

为了解决推荐营养液和推荐拌种根瘤菌用量不能发挥菜豆生产潜力的问题,设置了4因素2水平完全随机组合盆栽试验。结果表明,采用推荐营养液用量处理的菜豆平均干物质量较采用1/4推荐用量处理的提高了49.44%,根瘤菌数增加了58.32%。与氯化钙混合营养液相比,硫酸钙混合营养液处理后干物质量增加了29.45%。用4倍推荐根瘤菌用量拌种的菜豆根瘤菌数量较用推荐根瘤菌用量处理的增加了18.80%。     

AM菌根真菌和根瘤菌对四季豆生长影响的效应初报

为充分利用菌根菌的解磷作用与根瘤菌的固氮作用,减少化肥的施用,尝试给豆科植物接种AM菌剂和根瘤菌剂。通过室内和田间试验,结果表明,接种AM菌剂和接种根瘤菌剂可提高四季豆结瘤率和结瘤量(接种47d后结瘤量增多了67%)、增加根重和根径、促进四季豆生长、增加单果重及荚果大小,接种根瘤菌可增加根部土壤全氮含量和速效磷的含量,增加四季豆经济产量,最多达30%。     

不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化

土壤环境是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素,其类型、pH以及其他理化性质都能影响根瘤菌的接种效果。因此有必要对不同地区大豆根瘤菌的培养条件进行优化,使大豆接种根瘤菌,能够在植物根部产生大量有效根瘤,达到增产目的。研究通过单因素试验分析得到海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化的大豆根瘤菌的最佳培养条件。培养时间分别为48、48、48、96和48h;pH分别为6.0、7.5、6.5、8.0、6.5;转速分别为180、180、160、180、180r·min-1;培养温度均为28℃。     

基因工程根瘤菌表达融合蛋白GST-HAL1条件的优化及耐盐水平的提高

利用原核表达载体pGEX-4T-1构建重组质粒载体pGEX-HAL1，三亲本杂交转化根瘤菌，表达融合蛋白GST-HAL1。结果表明，与空白菌和未诱导工程根瘤菌相比，诱导后工程根瘤菌的耐盐水平有明显提高。通过检测不同温度、不同诱导时间和不同IPTG诱导浓度条件下融合蛋白的表达量，优化各个参数。在28℃的温度条件下，融合蛋白GST-HAL1表达量量明显增加；在IPTG浓度为1．0mmol·L^-1，诱导时间为3h的条件下，融合蛋白的表达量最高，培养基产生的融合蛋白为3．02mg·L^-1，占可溶性蛋白质的39．34％。本研究对今后利用基因工程技术研制新型生物肥料做了有益的尝试。     

施用不同有机酸对烤烟生化指标的影响

本试验选取3种有机酸进行大田灌根,以清水为对照,研究了其对烤烟生化指标的影响,结果表明:腐殖酸处理能够明显促进烟株地上部和地下部鲜干重的增加,苹果酸处理对团棵期以前的烟株具有早生快的作用;腐殖酸能够提高烤烟叶片质体色素含量,促进烟株光合作用,生育后期能够促使烟株适时落黄成熟,且施用腐殖酸能够提高烟株的抗逆性和抗衰老能力,MDA含量、SOD活性、GSH含量均以施用腐殖酸处理的效果最好。     

转烟草花叶病毒复制酶基因烟草的病毒抗性研究

对用根瘤农杆菌双质粒法导入烟草花叶病毒复制酶基因的转基因烟草后代的研究表明：转基因烟草抗烟草花叶病毒和马铃薯Ｘ病毒，但感染马铃薯Ｙ病毒，抗病毒的转基因烟草存在某种机制限制着病毒在植株内的转移，转烟草花叶病毒复制酶基因烟草植株内不产生该复制酶，其抗病毒的确切机制有等进一步研究。     

利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法

将水培65 d的烟株进行打顶处理,测定打顶和不打顶烟株上部叶的烟碱含量。分别提取根中总RNA,利用腐胺-N-甲基转移酶(PMT)基因特异引物进行actin做内参的半定量RT-PCR,分析打顶前后PMT转录水平。结果表明,上部烟叶烟碱含量和腐胺-N-甲基转移酶基因表达量的变化趋势是一致的。