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相似文献
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1.
根据CyclinE(细胞周期蛋白E)基因序列,设计siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带U6启动子真核表达载体,构建针对CyclinE基因的shRNA真核表达载体.酶切和测序鉴定确认载体构建成功后,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白表达检测转染效率,RT-PCR法检测载体对CyclinE基因的表达抑制效果.实验结果显示CyclinE基因的RNAi真核表达载体构建成功,转入HeLa细胞后可以特异抑制细胞中CyclinE基因的表达.其中靶向(+797~+819)位点的质粒干扰效果较好,基因表达抑制率为59%.这些结果为利用该载体抑制CyclinE基因进行宫颈癌基因治疗研究奠定了基础.  相似文献   

2.
目的:克隆人端粒保护蛋白(human proteetlon of telomeres 1.pot1)基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法:RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测hpot1基因的表达水平。结果:来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论:真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。  相似文献   

3.
目的探讨GPC3-siRNA真核质粒载体构建并转染Huh-7细胞的可行性。方法构建真核质粒载体pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633,采用脂质体法瞬时转染至Huh-7细胞中。MTT法检测转染后Huh-7细胞的细胞活性,荧光定量PCR、Western blot分别检测GPC3 mRNA和蛋白表达。结果 GPC3-siRNA-1633基因和GPC3真核质粒载体转染Huh-7细胞后细胞存活率高,转染GPC3-siRNA-1633的Huh-7细胞出现GPC3 mRNA和蛋白表达下调。结论 GPC3-siRNA-1633可成功转染至Huh-7细胞,并抑制GPC3表达。  相似文献   

4.
【目的】研究小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞CyclinE基因表达及细胞周期的影响。【方法】合成针对CyclinE基因1 252和568位点的siRNA片段,并利用脂质体法转染家蚕BmN细胞,于共聚焦荧光显微镜下观察转染情况;应用实时荧光定量PCR法检测CyclinE mRNA的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】siRNA对家蚕BmN细胞的转染效率达80%左右。转染1252-siRNA-CyclinE和568-siRNA-CyclinE 48h后,分别使家蚕BmN细胞CyclinE mRNA表达量降低了68%和90%;流式细胞仪检测结果显示,2个转染组G0/G1期细胞比例显著增大,S期和G2/M期细胞比例显著减小。【结论】在家蚕BmN细胞中导入针对CyclinE的siRNA,可有效抑制CyclinE基因的表达,使细胞周期阻滞于G1期,进而抑制细胞增殖。  相似文献   

5.
张龙  黄文强  卞春东  高明 《安徽农业科学》2011,39(25):15368-15369,15376
[目的]克隆小鼠白细胞介素-5(mIL-5)cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。  相似文献   

6.
【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(CDK9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪CDK9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出包含完整开放读码框架(ORF)的CDK9 cDNA片段,将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组真核表达载体pEGFP-CDK9。将pEGFP-CDK9以脂质体介导法转染至SUVEC细胞,采用绿色荧光标记和Western blot检测SUVEC细胞中CDK9基因的表达,用流式细胞仪检测转染CDK9基因后SUVEC细胞周期的变化。【结果】得到猪CDK9基因全长1820bp的cDNA序列,其ORF为1119bp,编码372个氨基酸;CDK9分子质量为42.76ku,等电点为9.04;CDK9基因定位于猪的1号染色体上。酶切和测序结果证明,重组真核表达载体pEGFP-CDK9构建成功。pEGFP-CDK9转染SUVEC细胞48h后,荧光显微镜和Western blot检测到目的基因序列在SUVEC细胞中成功表达;试验组各期SUVEC细胞比例与空载体组相比,差异无统计学意义(P0.05),细胞周期未发生显著变化。【结论】克隆了猪CDK9基因,并在SUVEC细胞中成功进行了表达。CDK9基因的过表达未引起细胞周期发生显著变化,其可能并不参与细胞周期的调控。  相似文献   

7.
犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达   总被引:2,自引:2,他引:0  
[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。  相似文献   

8.
【目的】研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸变异与抗病性的相关性。【方法】用已经构建成功的中国狼山鸡Mx蛋白基因突变型pcDNA3.0-MMx和未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体分别转染鸡成纤维(CEF)细胞和鼠成纤维(NIH-3T3)细胞;利用RT-PCR检测突变型MMx基因和未突变型Mx基因的表达,微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒(NDV)和水泡性口炎病毒(VSV)的效果。【结果】诱变鸡Mx基因的表达重组蛋白可保护CEF细胞在孵育48 h内免受NDV的感染;转染突变型pcDNA3.0-MMx真核表达载体的NIH-3T3细胞在孵育60 h内亦未受到VSV的浸染;而转染未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体的CEF和NIH-3T3细胞在24 h内均发生了病变。【结论】体外重组突变的Mx蛋白在单细胞水平上具有延缓NDV和VSV感染的能力。  相似文献   

9.
DKK2基因是Wnt信号通路的关键抑制因子,在胚胎发育、颗粒细胞生成等过程中发挥重要作用。扩增了牛DKK2基因CDS序列,构建了DKK2基因pc DNA3.1真核表达载体;为进一步验证载体在细胞内的表达效果,将表达质粒瞬时转染CHO细胞,利用q RT-PCR和Western blot检测DKK2的表达情况。结果表明,在CHO细胞中转染DKK2基因的真核表达载体质粒,其m RNA和蛋白质表达量均显著上升,表明已成功构建了DKK2基因表达载体,为下一步开展DKK2基因功能研究奠定了基础。  相似文献   

10.
用RT-PCR方法从猪肝组织中扩增出猪PDCD5(programmed cell death 5)编码序列,TA克隆至pMD-19T载体中,软件分析猪PDCD5基因的核算序列和蛋白序列,进行染色体定位.构建真核表达载体,将PDCD5基因编码区序列插入绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中.通过脂质体转染法将重组载体瞬转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs)进行瞬时表达.结果表明:该序列编码125个氨基酸,猪PDCD5基因定位于猪6号染色体,含有6个外显子,与人PDCD5基因高度同源.双酶切鉴定和测序表明:重组真核表达载体构建成功,荧光检测和Western blot检测显示PDCD5融合蛋白表达.研究结果为探讨猪PDCD5基因在细胞凋亡调控中的功能提供了基础数据.  相似文献   

11.
【目的】研究在幼仓鼠肾细胞(BHK-21)悬浮培养过程中,不同浓度氨对其生长代谢的影响。【方法】用添加0,1.8,2.5,5.5,8.0和15.0 mmol/L氨的培养基培养BHK-21细胞,每隔12 h取样1次,用细胞计数仪进行细胞计数,测定细胞活力,采用AO/EB双染色法和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪2种方法检测细胞的凋亡情况,同时测定细胞培养过程中葡萄糖、氨和乳酸浓度的变化。【结果】在BHK-21细胞连续培养过程中,当氨的添加浓度低于1.8 mmol/L时,其对细胞的生长几乎不产生抑制作用,细胞活性、细胞总数与对照组差异不显著,未出现细胞聚集成团现象;当氨添加浓度达到15.0 mmol/L时,BHK-21细胞直接进入死亡期;当氨的添加浓度为2.5~8.0 mmol/L时,氨对细胞生长的抑制作用由弱变强,这种抑制作用在细胞培养至24 h开始出现。另外,随着氨添加浓度的增加,葡萄糖的消耗量减少,细胞代谢产生的乳酸和氨降低。【结论】氨对悬浮培养的BHK-21细胞的生长和代谢有显著影响。  相似文献   

12.
利用透射电镜观察了山羊胚胎心肌细胞分化发育过程中超微结构的变化。结果表明 :2 6日龄的山羊胚胎心肌细胞内肌节初步形成。随着胚胎发育 ,心肌细胞的肌节逐步完善 ,心肌细胞内的线粒体数量逐渐增多 ,排列规则 ,线粒体嵴逐渐变密 ,心肌细胞之间的连接也随着胚胎的生长发育逐渐形成和加强 ;2 6日龄山羊胚胎心肌内可见粗面内质网 ;34日龄的山羊胚胎心肌细胞胞浆内可见肌浆网、肌膜下池、横小管和二联管已形成 ;山羊胚胎心肌细胞内糖原颗粒丰富 ,随着胚胎日龄的增长 ,胞质内散布的糖原颗粒呈减少的趋势 ,而肌丝之间的糖原颗粒呈增加趋势 ;2 6日龄的山羊胚胎心房肌内出现少量特殊颗粒  相似文献   

13.
【目的】比较体外条件下不同分离山羊卵巢间质细胞(ovarian interstitial cells)方法的效果。【方法】采用热消化法、冷消化法、单一酶消化法(热消化法,用Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅺ型胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA)及2步酶消化法分离山羊卵巢间质细胞。【结果】热消化法得到的细胞数量较冷消化法多,且试验所用时间缩短,但细胞活率降低。单一酶热消化法中,以1g/LⅪ型胶原酶效果最佳,适合体外培养。2步酶消化法以先胰蛋白酶后Ⅺ型胶原酶组的效果最佳,卵巢组织消化时间及体外培养首次换液时间均较短,适合于体外培养。【结论】采用1g/LⅪ型胶原酶单一酶热消化法或先胰蛋白酶后Ⅺ型胶原酶2步酶消化法,分离山羊卵巢间质细胞的效果均较好,可作为试验用卵巢间质细胞的理想分离方法。  相似文献   

14.
目的探讨大鼠骨髓干细胞的体外分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的的可行性,并检测其表型和功能。方法取大鼠长骨骨髓细胞,第3代细胞传代后加用终质量浓度10μg/L的血管内皮生长因子(VEGF)的细胞因子,培养3 d后行内皮细胞特异性成分鉴定。结果(1)免疫组化染色鉴定:P3代CD133呈中度阳性表现,CD34呈弱阳性表现;经VEGF诱导后表达明显增强。(2)流式细胞仪细胞计数鉴定:P3代CD133、CD34阳性细胞率分别为97.3%、55.5%;经VEGF诱导后CD133、CD34阳性细胞率分别为91.4%、78.6%。(3)P3代VEGF诱导后乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)、荆豆凝集素(UEA)双染鉴定:经VEGF诱导的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(70.2±5.1)%,未经VEGF诱导后的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(20.4±3.8)%。(4)RealTime-PCR检测第3代VEGF cell和三代cell的内皮细胞特异性成分表达:P3 VEGF cell血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)浓度是P3cell的2.22倍。结论用贴壁筛选法和VEGF细胞因子培养大鼠骨髓干细胞可以获得较高纯度的内皮祖细胞(EPCs),该细胞具有内皮祖细胞的特性,可用于进一步向内皮细胞分化的研究与应用。  相似文献   

15.
一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法   总被引:1,自引:0,他引:1  
尝试建立一种简便有效的成年小鼠精原干细胞分离培养及扩增的方法。从单只成年小鼠的睾丸中经过两步酶消化法分离精原干细胞,并在去除间质细胞、纯化后的支持细胞饲养层上培养与扩增,获得稳定增殖的精原干细胞系。此方法可显著提高建系成功率,保证细胞系的单一基因型,显著降低体外培养精原干细胞的成本。为成体基因来源的转基因动物的制作和疾病模型的建立提供技术支持。  相似文献   

16.
为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞大都长梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达98%以上。说明该方法能够成功分离并得到高产量、高纯度、高增殖能力的子宫内膜细胞及平滑肌细胞。  相似文献   

17.
北京鸭视网膜移动性无长突细胞的分布   总被引:2,自引:0,他引:2  
利用视神经溃变试验和Nissl染色法研究了北京鸭视网膜移动性无长突细胞 (dACs)的形态、大小与密度分布。北京鸭dACs是位于视网膜节细胞层的小神经元 ,核深染 ,胞质很少 ,细胞体呈圆形或卵圆形 ,细胞大小均一 ,平均面积为 19~ 2 5 μm2 。在视网膜中央有一个dACs高密度区即中央高密度区 (CA ,386 0个·mm-2 ) ,dACs的密度由视网膜中央部向视网膜周边部逐渐降低 (TP ,约为 1780个·mm-2 ;NP ,约为 176 0个·mm-2 )。试验结果表明北京鸭视网膜中央部和周边部的dACs大小差异不明显 ,但dACs在节细胞层密度分布不均 ,呈现由视网膜中央部至周边部密度梯度递减的变化  相似文献   

18.
鱼类是优质动物蛋白的重要来源,其中养殖鱼类占重要地位,而通过选择育种、杂交育种等传统方法和分子辅助育种、基因编辑等新技术培育优良品种是鱼类养殖业健康持续发展的关键。近年来,鱼类干细胞技术特别是细胞移植和诱导技术快速发展,为鱼类优良品种培育提供了新的技术途径。介绍了鱼类干细胞育种的现状及应用,总结了鱼类干细胞育种技术面临的问题,并对其发展前景进行了展望,旨在为鱼类育种技术研究提供参考。  相似文献   

19.
【目的】探讨印楝素(azadirachtin, AZA)通过转录因子FOXO诱导草地贪夜蛾卵巢细胞sf9凋亡的分子机制。【方法】将体外培养的草地贪夜蛾卵巢细胞分为AZA处理组和未处理组,采用CCK-8法检测AZA 对sf9 细胞增殖的影响;透射电镜观察sf9细胞的超微结构变化;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞;Western blot 检测p-FOXO及凋亡相关蛋白的表达情况; RNAi FOXO后,检测FOXO基因表达量与Caspase-3的酶活性变化。【结果】CCK-8检测发现AZA可显著抑制sf9细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;通过透射电镜检测到5 mmol/L AZA可破坏sf9细胞的微观结构,导致细胞核收缩,染色质聚集,细胞质空泡状;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞,发现AZA诱导sf9细胞凋亡与时间呈正相关;进一步通过Western blot检测凋亡相关蛋白,发现AZA可诱导凋亡相关蛋白 Bim和 Cleaved Caspase-3的表达水平显著增加,而P-FOXO蛋白表达量降低,FOXO总蛋白表达无明显差异;利用qRT-PCR进一步检测发现,FOXO基因表达量与AZA处理时间呈正相关,在此基础上通过RNAi技术沉默FOXO后,经AZA处理发现Caspase-3的酶活性显著降低。【结论】AZA可通过上调FOXO基因抑制草地贪夜蛾卵巢细胞sf9的增殖并诱导其凋亡。  相似文献   

20.
为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。  相似文献   

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