H9N2型禽流感病毒HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用RT-PCR技术扩增出禽流感病毒HA基因的cDNA。将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis,筛选到重组质粒,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-NBlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueBacHisH9HA。提取重组病毒DNA,经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中,血凝实验、SDS-PAGE实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的Highfive细胞中获得了表达。     

双表达H9N2禽流感病毒HA基因的假型重组杆状病毒系统的构建

以含有H9N2禽流感病毒HA基因的重组质粒pMD18-H9HA为模板,扩增HA基因,将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将含有H9HA及gp64的基因片段克隆到质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA-H9-HA.然后将含有CMV启动子、H9HA及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质...     

水稻瘤矮病毒髓和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus，RGDV）主要内层衣壳蛋白53基因和外层衣壳蛋白鼹基因的重组杆状病毒，将目的基因（S3和S8）分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子（PH）和plO启动子的下游．经酶切和确证性序列测定，将其转化到DHl0Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rbpFBDS3-S8，采用脂质体转染法，将rbpF-BDS3-58转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Si9细胞包装病毒，PCR筛选鉴定重组病毒．结果表明：SD昆虫细胞被侵染72h后，倒置显微镜下观察到细胞增大，培养液和细胞内出现颗粒状物质，部分细胞破裂甚至裂解，说明53和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中，这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础．     

表达禽流感病毒血凝素基因的重组禽痘病毒的构建

 为构建表达禽流感病毒 ( AIV)血凝素 ( HA)基因的重组禽痘病毒 ,将禽痘病毒启动子LP2 EP2驱动的 H7亚型 AIV HA基因 c DNA和大肠杆菌 Lac Z基因插入禽痘病毒疫苗株 F- 0 1 7的复制非必需区。经蓝斑筛选后 ,对重组病毒又进行了 3次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板 ,利用 H7亚型 AIV HA基因特异的引物进行聚合酶链式反应 ,均扩增出 1条特异的1 .7kb DNA条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验 ,均检测到 HA蛋白 ,表明 H7AIV HA在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为 AIV病毒活载体疫苗的研制奠定了基础     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

新城疫病毒F和HN核心片段在杆状病毒中的表达

为研制抗新城疫病毒的基因工程疫苗，将新城疫病毒F48E8株F和HN基因的核心片段克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中，然后转化到DH10Bac感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染TN5细胞，得到含F片段和含F HN片段的重组杆状病毒rBac F和rBac F HN。PCR扩增结果证实F和F HN基因片段重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE和Western blot检验结果表明F和F HN基因片段在重组病毒中得到了表达。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在杆状病毒中的表达及其免疫效力评估

旨在利用杆状病毒表达系统构建1株对高致病性H7N9亚型禽流感病毒（A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016）攻击后的家禽提供保护的候选疫苗株。用同源重组的方法构建1株表达H7N9亚型禽流感病毒（A/chicken/Shaoxing/5201/2013株）血凝素（Hemagglutinin, HA）蛋白的重组杆状病毒。用PCR技术鉴定重组杆状病毒rBac-SX5201HA的遗传稳定性,用间接免疫荧光方法和Western Blotting方法鉴定HA蛋白的表达情况,用血凝试验检测HA蛋白的体外活性,继而对重组疫苗在无特定病原体（Specific pathogen free, SPF）鸡上进行免疫效力试验,并对免疫后21 d的SPF鸡血清进行抗体检测,对攻毒5 d后的鸡咽喉和泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,重组杆状病毒rBac-SX5201HA在昆虫细胞中生长良好,且可稳定高效表达H7 HA蛋白,血凝效价可达2⁶;重组疫苗免疫SPF鸡21 d后可诱导2^8.4血凝抑制（Hemagglutinin inhibition, HI）抗体效...     

H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建

【目的】获得表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组禽痘病毒。【方法】将含禽痘病毒启动子LP2EP2驱动的HA基因,插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681/HA。用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA的重组禽痘病毒rFPV-HA。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组病毒进行多次蚀斑克隆,并用间接免疫荧光法对感染重组病毒鸡胚成纤维细胞中HA的表达产物进行鉴定。【结果】以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因特异引物进行PCR,扩增出1条约1.7 kb左右的带。以间接免疫荧光法证实重组禽痘病毒能表达HA。【结论】成功构建了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒,且构建的重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA。     

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白，为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗，评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性，优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列，将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中；接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中，通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功；再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验，建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法，筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间；最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后，Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变，表明重组杆状病毒拯救成功；通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现，Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号，特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右，与预期相符，且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应，表明 HA 重组蛋白表达成功；以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准，建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法，该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系，标准曲线的相关系数 R2=0.993；利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量，并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间，结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9，孵育 72 h，蛋白表达效果最好；通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白，蛋白浓度为 0.268 mg/mL，鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白，并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法，可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCC VR-2332株GP5基因序列设计1对特异性引物，应用RT—PCR方法扩增PRRSVHn／06-1分离株GP5基因片段．将扩增片段克隆到真核表达载体pcDNA3．0中，测序后用DNAstar序列分析，构建的pcDNA—GP5重组质粒瞬时转染293T细胞，48h后用Western-blot检测。证明GP5基因在293T细胞中获得了表达，可与PRRSV阳性血清发生特异性反应．     

表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.     

表达鸡传染性支气管病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒M41株的基因序列(GenBank:AY851295.1),设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增其S1基因,并将扩增产物克隆到杆状病毒转移质粒pFast-VSV-G-CMV中,获得重组质粒pFast-VSV-G-CMV-S1,进一步将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-CMV-S1,再利用脂质体转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-V-S1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达S1蛋白.     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达

利用PCR方法扩增日本乙型脑炎病毒(JEV)E全长基因,然后将其克隆到杆状病毒转座载体pBac-SC中,筛选重组质粒pBacSC-E,再转化入含有穿梭载体的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含E基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。用此重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经Western-blot检测表明,E基因在昆虫细胞中获得表达,表达蛋白的分子量约53 ku,与预期结果大小一致,且能与日本乙型脑炎阳性血清发生特异性反应,这为进一步研究JEV亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。     

Shiva 1a基因在杆状病毒中的表达及其表达产物抑菌活性的检测

根据GenBank上公布的shiva-1a的成熟肽基因序列,人工合成shiva-1a基因并加入6×His标签.将shiva-1a基因克隆到杆状病毒转座载体pBacFast-Dual中,筛选重组质粒,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法转染Sf-9昆虫细胞,待细胞出现病变后,收集上清液从而获得重组杆状病毒.用此杆状病毒感染的Sf-9细胞,Western blot检测出分子量约5 ku的shiva-1a多肽,与预期结果大小一致.体外抑菌试验证明,表达的shiva-1a多肽对大肠杆菌(DE3菌株)具有抑菌活性.     

鸭圆环病毒Cap 基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。     

H5亚型AIV的HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的2对引物。然后以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dualH-A1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因的真核表达及其产物的免疫原性

采用RT-PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M 41株的全长S1基因,并将其片段连接到pGEM-T载体,经酶切、PCR及序列测定表明,获得的S1基因ORF全长为1 659 bp,与G enB ank上公布的IBV M 41 S1基因序列一致。将S1基因与真核表达质粒pVAX 1连接,构建重组真核表达质粒pVAX 1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测转染细胞S1蛋白的表达。同时以重组质粒免疫小鼠,可诱导产生特异性针对IBV S1蛋白的抗体(P<0.01)。这为鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

表面展示猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组杆状病毒的构建

利用PCR方法扩增猪圆环病毒2型核定位信号区缺失的Cap蛋白基因,将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1的gp64信号肽和gp64成熟蛋白之间.将此融合片段亚克隆到质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-gp64-dCap.然后将含有CMV启动子,gp64及dCap的基因片段克隆到杆状病...