H1N1亚型猪流感病毒M基因、NS基因克隆与序列分析

根据GeneBank 中流感病毒 H1N1亚型M基因和NS基因序列,分别设计扩增M基因和NS基因的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪流感病毒天津株M基因和NS基因,分别将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行序列测定和分析.结果显示M基因全长1027 bp,其核苷酸序列与参考毒株间的同源性在85.8 %～99.7 %,NS基因全长890 bp,与参考毒株之间的核苷酸序列同源性在80.7 %～99.2 %.M和NS基因的系统发育树显示:TJ2、TJ4株与我国香港、上海和广东H1N1亚型猪流感病毒属同一分支,但与上海、广东分离株的亲缘关系更近;与2009年全球流行的人甲型H1N1流感病毒变异株和部分国外猪流感疫苗株的亲缘关系相对较远.     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E．coil中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N，进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp，编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100％。将pGEM—N双酶切．回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中，构建了重组质粒pET—N；将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明：重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实，重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析，重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43％。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达

据GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列设计并合成引物，以H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板，用R1PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因，将此扩增产物克隆进pMD18-T载体，采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子结果表明HA基因长为1683bp。基于HA信号肽在表达中的负作用，研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码户列，获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因，将其亚克隆到pGEX-KG中，与GST融合表达。SDS-PAGE显示：融合表达的蛋白分子量乡为90kDa。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1蛋白原核表达载体的构建及表达

为对H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)NS1基因进行原核表达,并对表达产物进行抗原性分析,根据NS1基因合成1对特异性引物,进行PCR扩增,将扩增片段连接至PMD18-T载体,通过序列测定和比对筛选出保真基因克隆;将保真基因克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a-NS1后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达;并对IPTG使用浓度和诱导时间进行优化,对表达的重组蛋白用His-tag镍柱进行纯化,利用Western Blot和免疫荧光技术对纯化的重组蛋白进行鉴定及免疫原性的测定。结果显示,本试验成功扩增出H9N2 AIVs的NS1基因,并筛选到保真克隆;带有NS1保真基因的重组载体pET32a-NS1可在大肠杆菌中进行IPTG诱导表达,其中,IPTG最佳使用浓度为2 mmol/L、最佳诱导时间为8 h时表达量最大,并且表达产物主要存在于包涵体中;纯化后的重组蛋白可被抗His标签识别,利用重组蛋白制备的抗体可识别H9N2 AIVs在细胞内表达的NS1蛋白,说明重组蛋白具有良好的免疫原性,该试验为H9N2 AIVs NS1蛋白的功能特性和免疫学研究奠定了基...     

猪流感病毒低密度分型芯片的试验研究

根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV) H1 N1、H3N2、H5N1和H9N2亚型的血凝素(HA)基因序列,分别设计各亚型的特异引物,并根据A型流感病毒的M基因序列设计引物,作为4种病毒亚型的通用引物.应用RT-PCR分别扩增各病毒亚型HA基因的特异片段和M基因片段,并克隆到pMD19-T Simple Vector构建重组质粒,经测序后,用于各病毒亚型探针的制备.将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制备成低密度基因芯片.在多重PCR过程中,用生物素标记的dUTP( Bio-11 -dUTP)对待检样品进行标记,扩增产物与制备的基因芯片进行杂交,最后用扫描仪进行读片和分析.结果表明,该方法可以同时检测4种SIV病毒亚型,与PCR方法相比,显示了较高的灵敏度.该方法的建立,为SIV分型和猪流感疫情的监测提供了一种快速、灵敏和高通量的手段.     

H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析

从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增的778 nt片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框．核苷酸序列比较分析结果表明,该毒株与A／Swine／Texas／4199-2／98(H3N2)、A／Swine／Iowa／533／99(H3N2)、A／Swine／HongKong／126／ 82(H3N2)、A／Swine／Pingtung／7-12／99(HIN2)核苷酸序列的同源性为92．7％～98．6％,推导的氨基酸序列同源性为92．6％～96．3％．     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

RT-PCR技术检测猪流感病毒

根据猪流感病毒(SIV)的M基因的序列,设计合成了1对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR方法.应用该方法对H1、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp的特异性目的片段,而对PRRSV、PCV2、PRV、CSFV进行同条件检测,结果均为阴性;SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99%～100%.敏感性试验表明,该方法可检测到103 EID50的SIV;可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

Identification of an H1N1 subtype of swine influenza virus and serological analysis

To investigate the epizootic of swine influenza virus(SIV), 60 nasal swabs were collected from a clinical cases of pig farm in Tai'an City, Shandong Province of China in April 2017. SIV was isolated by inoculating into 10-day-old Special Pathogen Free embryonated eggs and the whole genome was sequenced. An H1N1 subtype SIV was isolated and designated as A/swine/Shandong/TA04/2017(H1N1). Phylogenetic analysis showed that apart from the polymerase A(PA) fragment belonging to the 2009 pandemic H1N1 branch, seven genome segments belonged to avian-like H1N1 influenza virus lineage. The cleavage site sequence of the hemagglutinin(HA) protein was PSIQSR↓G, which is a typical molecular biological characteristic. Five potential N-glycosylation sites(N14, N26, N277, N484 and N543) were found in the HA gene. To further investigate the epidemiology of SIV in this farm, the 995 serum samples were assessed with EAH1N1 2009 pandemic H1N1 and H3 N2 antigens. The results showed that the total positive rate was 65.43%. The positive rates of single virus infection detected by EAH1N1, 2009 pdmH1N1 and H3 N2 for serum HI(Hemagglutination inhibition) were 48.35, 30.85 and 7.47%, respectively. The results showed that SIV in Shandong Province has been reassorted in some segments and the SIV-positive rate was high on the SIV outbreak farm. These data provide evidence of an epizootic of SIV.     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

 【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术，对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1，并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株，研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后，血凝价最高仅为1﹕64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1﹕1 024，表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪，首免2周即可检测出HI抗体，平均效价在1﹕32以上，三免后2周HI抗体平均效价达到1﹕512，说明其有良好的免疫原性。【结论】H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。     

A型流感病毒中国分离株PB1-F2基因进化分析

 【目的】明确国内鸡源H9N2禽流感病毒（AIV）的PB1-F2基因分子进化特征,并进一步全面了解国内A型流感病毒（IAV）流行株的PB1-F2的流行情况。【方法】对分离自北方发病鸡群中的14株H9N2亚型 AIV进行了PB1-F2基因的克隆和序列测定,并从GenBank数据库下载了禽源、猪源和人源H5N1和H9N2亚型AIV、人源和猪源H1N1和H3N2 IAV的PB1基因共计337个,系统的对国内不同宿主来源的IAV 的PB1-F2基因进行了分子进化分析。【结果】上述IAV的PB1-F2基因形成了6个不同的进化分支。推导的PB1-F2蛋白表现出长度的多态性,因IAV的HA类型和宿主来源的不同,其表达功能性PB1-F2蛋白的比率也存在差异。【结论】本研究明确了国内IAV 的PB1-F2基因的系统进化特征,为该基因功能的研究提供了分子流行病学资料。     

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸(neuraminidase,NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010(简称DK/NJ/1102)进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接p GEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用Gen Bank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与Gene Bank中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为"P-E-K-A-S-R-G",符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。     

一株鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006的全基因组序列测定及遗传演化分析

为了解鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006(DK/SH/Y20/06)的来源、特征及其分子演化规律,进一步丰富水禽流感病毒的基因库,对该病毒8个基因片段分别进行了扩增和序列测定,利用分子生物学软件对测序结果进行序列分析,并与GenBank登录的相关病毒进行了遗传演化分析。结果表明,DK/SH/Y20/06的HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于欧亚分支;NA基因与A/mallard/Yanchen/2005(H4N6)在同一分支内,核苷酸序列同源性为98.3%;而PB2、PB1、NP、PA基因与目前在国内流行的H6亚型禽流感病毒关系密切;M基因与A/environment/Korea/CSM05/2004(H3N1)处于同一分支;而NS基因与A/wild duck/Korea/YS44/2004(H1N2)同源性最高。且DK/SH/Y20/06的8个基因与美洲H4N6亚型AIV分离株均不处在同一遗传进化分支上,相互之间遗传关系较远。可见,DK/SH/Y20/06可能是由H4N6、H6N2、H6N5、H3N1和H1N2等不同亚型来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。