大肠埃希氏细菌中ESBLs耐药质粒的传播与消除研究

【目的】研究大肠埃希氏细菌中超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)耐药质粒的传播及氯丙嗪对其的消除效果。【方法】采集河南开封和安阳疑似大肠埃希氏细菌病病死鸡、猪典型病料,经细菌学检验后,用试管二倍稀释法测定头孢噻呋和头孢曲松对致病性大肠埃希氏细菌的最小抑菌浓度(MIC),用双纸片协同法和PCR扩增法进行ESBLs检测。以安阳猪和开封鸡大肠埃希氏细菌作供体菌、DH5α为受体菌,进行ESBLs耐药质粒的接合传递试验。用氯丙嗪作消除剂,以SDS为对照,对大肠埃希氏细菌分离株ESBLs耐药质粒进行消除试验。【结果】从疑似大肠埃希氏细菌典型病料中分离到了大肠埃希氏细菌;头孢噻呋和头孢曲松对分离菌株的最小抑菌浓度分别为32~64和64~128μg/mL;检测到了ESBLs耐药质粒的存在,且其能在大肠埃希氏细菌间传播,氯丙嗪对其第12次的消除率高达98.83%。【结论】ESBLs耐药质粒可通过接合转移方式传递至感受态大肠埃希氏细菌中,氯丙嗪对其消除效果很好。     

响应面法优化绿僵菌产绿僵菌素A的培养条件

【目的】优化绿僵菌Metarhizium anisopliae产绿僵菌素A的培养条件,提高绿僵菌素的产量。【方法】应用响应面法设计试验,以Plackett-Burman试验设计和中心组合试验设计筛选得到影响绿僵菌液体发酵的关键因素。【结果】试验得到1个拟合程度高、误差小的模型,该模型给出的最佳培养条件为:蔗糖22.7 g·L~(–1)、蛋白胨13.4 g·L~(–1)和发酵时间9.70 d,预测绿僵菌素A最大质量浓度为6.90μg·mL~(–1),实际测得质量浓度为6.89μg·mL~(–1)。【结论】结果可为绿僵菌大规模发酵获得粗毒素提供理论依据,使绿僵菌粗毒素的广泛开发与应用成为可能。     

猪、鸡大肠杆菌ESBLs的基因型检测

【目的】检测致病性大肠埃希氏菌中超广谱β-内酰胺酶(Extendβ-lactamase,ESBLs)的基因型,指导兽医临床合理用药。【方法】对产生ESBL的5株致病性大肠埃希氏菌,设计并合成TEM-1和SHV-1两对引物,用PCR方法进行了ESBLs耐药质粒的DNA扩增、测序和基因型分析【结果】以产生ESBLs细菌的ESBLs耐药质粒为模板均扩增出了与预期片段大小相符的TEM型ESBL产物,但都没有扩出SHV型ESBL产物。【结论】结果提示国内畜禽产生ESBLs的致病性大肠埃希氏菌未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换;ESBLs的产生与动物种属没有关系;为克服细菌的该类耐药性问题,应该进行头孢噻呋复方制剂的研究。     

致病性大肠埃希氏菌ESBLs基因型的检测及其抑制剂的抑酶保护作用

【目的】检测致病性大肠埃希氏菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型,初步研究β-内酰胺酶抑制剂(BLI)-他唑巴坦的抑酶保护作用。【方法】对产生ESBLs的5株致病性大肠埃希氏菌,设计并合成TEM-1和是SHV-12对引物,用PCR方法进行了ESBLs的DNA扩增、测序和基因型分析;用试管二倍稀释法测定头孢噻呋与BLI-他唑巴坦钠以不同配比对产生ESBLs大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度。【结果】从产生ESBLs细菌中均扩增出了TEM型ESBLs产物,但未扩增出SHV型ESBLs产物;头孢噻呋与BLI-他唑巴坦钠(质量比1∶1～8∶1)联合使用,对产生ESBLs的大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度较头孢噻呋单独使用基本降低,最高可降低16倍。【结论】国内畜禽产生ESBLs的大肠埃希氏菌未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换,ESBLs的产生与生物种属没有关系,BLI-他唑巴坦有较强的抑制ESBLs作用。     

肠出血性大肠埃希菌噬菌体裂解酶的毕赤酵母重组表达及裂解活性分析

为研究噬菌体V-EcoM-C1所编码裂解酶LysC1的裂解活性,在酵母菌GS115中重组表达裂解酶LysC1,并检测裂解酶LysC1对大肠埃希菌的裂解活性。结果表明:通过甲醇诱导后,含有裂解酶基因LysC1的重组表达质粒pPIC9K-LysC1能够在酵母菌GS115中表达,重组蛋白LysC1的分子量约为25ku,以外分泌方式表达,经HIS-trap HP(GE)亲和层析柱纯化后可获得有活性的重组蛋白LysC1,且该裂解酶对多种不同O抗原类型的肠出血性大肠埃希菌均具有较高的裂解活性,其最小抑菌浓度(MIC)为100μg·mL~(-1)。这一研究利用酵母表达系统成功表达出大肠埃希菌噬菌体裂解酶,且该裂解酶无需穿孔素等破膜因子的辅助,可直接裂解大肠埃希菌,为肠出血性大肠埃希菌的防控提供了新的思路和途径。     

F17大肠埃希菌黏附湖羊小肠上皮细胞模型的初步建立

为探究F17大肠埃希菌对湖羊小肠上皮细胞的黏附机制,以体外培养的小肠上皮细胞和F17大肠埃希菌为研究对象,根据黏附后培养过夜的菌落数,调整黏附时间与感染复数(MOI),获取最佳黏附条件,初步建立F17大肠埃希菌黏附小肠上皮细胞的细胞模型;利用实时荧光定量PCR分别检测F17大肠埃希菌黏附后及脂多糖(LPS)诱导后的白细胞介素(IL)-6、IL-8和IL-1β的表达情况来鉴定该模型。结果表明:F17大肠埃希菌黏附3 h与黏附1、2、4 h时,黏附MOI=100∶1与MOI=200∶1、400∶1、500∶1差异显著,即F17大肠埃希菌黏附MOI=100∶1、黏附时间3 h为最佳黏附条件;小肠上皮细胞免疫相关基因的表达量随黏附时间、诱导时间发生显著变化;与LPS诱导模型相比, F17大肠埃希菌黏附模型更能模拟细菌黏附细胞的生理状态,说明模型建立成功。     

虾青素缓解脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤

【目的】研究虾青素(AST)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝损伤的影响。【方法】健康雄性ICR小鼠40只随机分为4组,包括对照组、AST组、LPS组和虾青素预保护组(AST+LPS组)。记录小鼠体质量并计算肝脏系数;通过ELISA法检测血清中髓过氧化物酶(MPO)含量;生物化学法测定肝组织中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性;荧光定量PCR法检测抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的mRNA相对表达量;通过HE染色观察各组肝脏细胞形态和肝损伤程度。【结果】各组小鼠初始体质量均为18 g,末次称量与初始体质量相比增加9～11 g,但各组间体质量增加无显著性差异(P0.05)。与LPS组相比,AST+LPS组小鼠肝脏系数(0.054)、血清MPO质量浓度(10.20 ng·m L~(–1))和肝组织中MDA质量摩尔浓度(2.83μmol·g~(–1))显著降低(P0.05),抗氧化酶SOD(512.14 U·mg~(–1))、GSH-Px(848.91 U·mg~(–1))和CAT(61.53 U·mg~(–1))活性显著提高(P0.05),抗氧化酶mRNA的相对表达量均显著升高(P0.05),同时肝脏损伤程度低,肝细胞形态完整,排列均匀。【结论】虾青素可保护小鼠肝细胞形态,提高肝脏抗氧化水平,调节肝组织中抗氧化酶mRNA的表达,从而缓解LPS引起的肝脏氧化应激,减轻急性肝损伤。     

广州市售肉类食品源大肠埃希菌耐药性分析

【目的】了解广州市售肉类食品源大肠埃希菌的污染和耐药情况。【方法】自2011年7月至8月,从广州市各大农贸市场和超市采集市售肉类样品310份,其中猪肉253份,鸡肉57份。采用选择性培养基分离鉴定大肠埃希菌Escherichia coli,琼脂稀释法测定大肠埃希菌对19种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。【结果】310份样品中共分离到213株大肠埃希菌,分离率为68.7%,其中猪肉源177株,鸡肉源36株。受试菌株对复方新诺明、链霉素和四环素的耐药率超过75.0%,对氨苄西林、萘啶酸、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、环丙沙星、安普霉素、恩诺沙星、庆大霉素和头孢唑啉的耐药率为10.0%~60.0%,而对头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶、黏菌素和阿米卡星表现较为敏感,耐药率小于5.0%。鸡肉源大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶和磷霉素的耐药率均高于猪肉源大肠埃希菌,差异极显著(P0.01)。213株大肠埃希菌中82.2%为多重耐药菌。【结论】广州市售肉类食品存在较为严重的多重耐药大肠埃希菌污染,且鸡肉源大肠埃希菌耐药性较猪肉源大肠埃希菌严重。     

龙眼果实发育过程中果糖激酶活性及其基因表达分析

【目的】以石硖龙眼Dimocarpus longan cv.shixia为材料,研究了龙眼果实在发育过程中假种皮蔗糖、葡萄糖和果糖含量的变化规律,以及果糖激酶活性及其基因的表达变化情况.【方法】利用高效液相色谱测定果实糖含量变化;RT-q PCR测定基因表达变化量;构建原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中进行表达.【结果和结论】随着龙眼果实的发育,假种皮中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量逐渐增加,但进入成熟期后,糖含量水平趋于稳定;在果实成熟前,果糖激酶活性随着果实发育逐渐降低,由发育最初的25.97μmol·g~(-1)·h~(-1)下降到13.18μmol·g~(-1)·h~(-1),而在成熟时增大到22.44μmol·g~(-1)·h~(-1);荧光定量分析显示,龙眼果糖激酶基因的表达量在果实发育前期变化不大,而在假种皮迅速膨大、含糖量迅速上升时期则呈下降趋势;SDS-PAGE结果表明,成功构建了pET-32a-DlFRK原核表达载体,经IPTG诱导能够在大肠埃希菌中得到高效表达.     

大肠埃希菌内参基因gapA克隆表达及抗体的制备与应用

针对原核生物细菌作为内参蛋白至今鲜见报道,基于大肠埃希菌gapA基因编码的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白高度保守性,PCR扩增出人源大肠埃希菌益生菌Nissle1917的gapA基因并克隆入原核表达载体pET-28a(+),经IPTG诱导表达重组GAPDH蛋白。通过对重组蛋白的纯化并免疫BABL/c小鼠制备大肠埃希菌内参蛋白GAPDH多抗血清,结合SDS-PAGE和Western-blot试验。结果表明:GAPDH对大肠埃希菌及沙门氏菌属细菌代表株均具有良好的特异性识别反应。证明GAPDH蛋白可应用于原核生物细菌一类的内参蛋白,为深入研究肠杆菌,尤其是致病性大肠埃希菌和肠炎沙门氏菌的代谢通路以及合成生物学提供基础材料。     

虾青素对小鼠肝脏原代细胞氧化应激的影响

【目的】研究虾青素对过氧化氢(H_2O_2)诱导小鼠肝脏原代细胞产生氧化应激的影响。【方法】原位二步灌流法提取ICR小鼠的肝脏原代细胞,用丙二醛(Malondialdehyde,MDA)作为指标、采用H_2O_2处理建立氧化应激模型。采用流式细胞仪测定细胞中活性氧(Reative oxygen species,ROS)含量及凋亡水平变化,生物化学法测定细胞中MDA和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性,用荧光定量PCR检测抗氧化酶SOD、GSH-px mRNA的相对表达量,Western-blot检测细胞核中Nrf2蛋白相对表达量。【结果】使用5μg·mL~(–1)虾青素预保护细胞3 h,10μmol·L–1H_2O_2刺激3 h的情况下氧化应激模型效果最好。虾青素降低了H_2O_2诱导后小鼠肝脏原代细胞的细胞凋亡率以及ROS、MDA和GSH含量,提升了SOD、GSH-px的活性以及SOD、GSH-px的mRNA相对表达量,抑制了Nrf2蛋白的核转移。【结论】虾青素对H_2O_2诱导产生氧化应激的肝脏原代细胞具有保护作用。     

连翘酯苷A对内毒素致鸡脾淋巴细胞白介素-17的影响

[目的]研究内毒素和连翘酯苷A对鸡脾淋巴细胞中白介素-17(IL-17)水平的影响。[方法]将1日龄雏鸡正常饲养至50日龄时,心脏采血处死,表面消毒后,剖检用脾淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞,将脾淋巴细胞分为20个组,具体为4个剂量组×5个时间点。4个剂量组分别为:对照组、LPS组(5μg/m L)、连翘酯苷A预防低剂量组(200μg/m L连翘酯苷A+5μg/m L LPS)、连翘酯苷A预防高剂量组(400μg/m L连翘酯苷A+5μg/m L LPS)。5个时间点分别为0、6、12、24、48 h。通过采用ELISA和Real time-PCR方法检测脾脏淋巴细胞中IL-17水平。[结果]ELISA结果显示,与正常组相比,LPS组脾脏淋巴细胞中炎症因子IL-17含量升高;与LPS组比较,连翘酯苷A组脾脏淋巴细胞中上述炎症因子含量下降,表明脾脏中炎症因子的变化呈正相关性,通过抑制LPS诱导的鸡脾脏中上述炎症因子的升高,减轻炎症反应。Real time-PCR结果显示,与正常组相比,LPS组脾脏淋巴细胞中炎症因子IL-17 mRNA表达量升高;与LPS组比较,连翘酯苷A组预防组脾脏淋巴细胞中上述炎症因子表达量下降,变化呈相关性,试验表明连翘酯苷A可以通过转录水平抑制LPS诱导的鸡脾脏淋巴细胞中上述炎症因子表达量的升高,减轻炎症反应。[结论]连翘酯苷A抑制鸡脾脏淋巴细胞中IL-17水平,可起到抗炎功能。     

狭鳕鱼皮胶原肽对过氧化氢诱导的人成骨细胞氧化损伤作用

[目的]复制过氧化氢诱导人成骨细胞氧化损伤模型,探讨狭鳕鱼皮胶原肽保护作用机制。[方法]以人成骨细胞为研究对象,将对数生长期的细胞分为6组:正常对照组、H_2O_2损伤组、胶原蛋白肽低(100μg/m L)、中(300μg/m L)、高(600μg/m L)浓度组、阳性对照组(300μg/m L维生素E),CCK-8法检测成骨细胞的存活率,酶联免疫法检测细胞培养液中SOD、MDA的含量,PCR技术检测Foxo3amRNA的表达水平,Western blot技术检测Sirt1、Foxo3a的蛋白表达水平。[结果]与模型组相比,胶原肽组细胞存活率及SOD的水平升高,MDA含量下降,Foxo3amRNA及蛋白表达水平下降,Sirt1蛋白表达水平上升。[结论]300μmol/L H_2O_2可成功复制成骨细胞氧化损伤模型;一定浓度的胶原蛋白肽能降低MDA的含量,提高SOD水平,并具有抗氧化损伤功能,胶原肽对成骨细胞的保护作用可能与下调Foxo3a和上调Sirt1的表达水平有关。     

印楝素干粉的制备及生物活性测定

【目的】测定印楝素干粉及印楝素A、印楝素B的生物活性,建立印楝素干粉中印楝素含量的检测方法。【方法】采用乙酸乙酯浸提法制备印楝素干粉,HPLC法检测印楝素含量,叶碟法测定生物活性。【结果】处理24 h后,印楝素干粉对斜纹夜蛾Spodoptera litura 2龄幼虫和大菜粉蝶Pieris brassicae 3龄幼虫的AFC50值分别为0.28和70.71μg·m L~(-1),拒食活性明显高于印楝素A和印楝素B。【结论】该干粉制备方法不仅简单有效,且生物活性良好,具有推广应用价值。     

利用稻秆去除饮用水中五价砷的研究

[目的]为砷污染地下水体的修复研究提供依据。[方法]利用稻草秸秆作为吸附剂,研究稻秆长度、稻秆用量、pH值、干扰离子等因素对饮用水中五价砷去除的影响。[结果]当五价砷浓度为300μg/L,稻草秸秆长度为2 mm,秸秆用量为10.0 g/100 ml溶液,最佳pH值中性,吸附时间为24 h时,稻草秸秆对五价砷的去除率可达99%以上,符合国家饮用水标准。[结论]利用稻草秸秆去除饮用水中五价砷有一定的应用前景。     

茼蒿素类似物对几种害虫的生物活性研究

对茼蒿素类似物的生物活性进行了研究。浸叶法处理小菜蛾 2龄幼虫 ,12号和 2 0号化合物 5d后的 LC50 值分别为 4 98.74μg· m L-1和 2 99.82μg· m L-1;对菜粉蝶 3龄幼虫处理后 6d的L C50 值分别为 655.79μg· m L-1、 4 65.74 μg· m L-1,处理后 8d的 L C50 值分别为 3 82 .12 μg·m L-1、 2 78.86μg· m L-1。以 5μg/头的 12号和 2 0号化合物注射处理菜粉蝶 5龄幼虫 ,2 4 h后试虫的校正死亡率分别为 4 5.3 4 %和 68.86%。 12号和 2 0号化合物对致倦库蚊 3龄幼虫处理后 2 4 h的 L C50 分别为 9.91μg· m L-1和 6.2 1μg· m L-1。     

坛紫菜丝状体类囊体膜和光系统Ⅱ的分离鉴定

[目的]为深入研究坛紫菜的光合生理奠定基础。[方法]以坛紫菜丝状体为材料，用蔗糖密度梯度超速离心法分离纯化类囊体膜和光系统Ⅱ（PsⅡ）颗粒。[结果]色素带B1的吸收峰分别位于419、498、540、565和676nm，色素带B2、B3、B2．a、B2．b、B3．a．B3．b和B3．C的吸收峰分别位于419．436、485和676nm。类囊体膜B2的放氧速率和DCIP光还原活性分别为12μmol（O2）／[mg（Chl）·h]和2．3aeq／[mg（cm）·h]；B3的分别为37μmol（O2）／[mg（chl）·h]和25ueq／[mg（Chl·h）]；B3-b的分别为567Ixmol（O2）／[mg（Cra）·h]和168ueq／[nag（Chl）·h]；B3-c的分别为8．1μmol（O2）／[nag（Chl）·h]和23ueq／[mg（Chl）·h]；B2-b只有DcIP光还原活性（168ueq／[mg（Cra）·h]）。[结论]该研究为坛紫菜丝状体类囊体膜和光系统Ⅱ的分离鉴定提供了试验依据。     

水分胁迫对乐东拟单性木兰幼苗生长和生理特性的影响

[目的]考察不同水分胁迫条件下乐东拟单性木兰的生理及生长指标变化。[方法]以乐东拟单性木兰盆栽幼苗为试材，水分胁迫设5个处理，即田间持水量的10％、20％、40％、60％和80％，研究水分胁迫对乐东拟单性木兰幼苗生长的影响。[结果]乐东拟单性木兰的相对苗高增长量、相对地茎增长量、叶绿素含量及根系活力随土壤含水量提高而增加，在土壤含水量为60％田间持水量时达最大值，分别为13．67％、15．04％、1．463mg／g和50．89mg／（g·h），之后开始下降，在土壤含水量80％田间持水量时分别降到2．88％、5．56％、1．086mg／g、25．252mg／（g·h）；叶片游离脯氨酸含量变化趋势则与之相反，在土壤含水量为60％和80％田间持水量时游离脯氨酸含量分别达到最小值0.008μg/ml和最大值0．053μg/ml。[结论]土壤含水量为印％田间持水量时较适合乐东拟单性木兰幼苗生长。     

温度和盐度对栉江珧耗氧率和排氨率的影响

[目的]探讨温度和盐度对栉江珧耗氧率（OR）和排氨率（NR）的影响。[方法]设置5个温度梯度和5个盐度梯度，测定温度和盐度对栉江珧OR和NR的影响。[结果]在18～34℃范围内，栉江珧单位体重OR和NR均随温度升高而增加，分别为260．82～585．90μg/（g·h）和26．32～42．19μg/（g·h），OR和NR与温度的相关方程分别为：ORT=-16．14lt^2＋197．58t＋89．29l（R^2=0．9738）；NRT=-0．6981t^2＋8．4677t＋17．792（R^2=0．9733）：在21～41盐度范围内，栉江珧单位体重OR和NR先随盐度增加而降低，在盐度31时达最小值，然后随盐度增加而升高，其变化分别为：575．82～734．40μg/（g·h）和36．78～54．45μg/（g·h），0R和NR与盐度之间的相关方程分别为：ORs=37．929s^2一214．27s＋867．6（R^2=0．9872）；NRs=3．5442s^2-19．748s＋62．08（R^2=0．9461）；表明在正常盐度下，贝体能量消耗较低。[结论]温度和盐度对栉江珧OR和NR均有显著影响，     

γ-亚麻酸在RAW264.7细胞中的抗炎症作用机制（英文）

[目的]探讨γ-亚麻酸（GLA）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞产生炎症介质的影响及其机制。[方法]采用体外培养的巨噬细胞系RAW264.7细胞,待细胞生长至融合状态后加入不同浓度（0、12.5、25、50μmol/L）的GLA预孵4h,利用100ng/ml的脂多糖（LPS）刺激12h或0.5h,同时设空白对照和LPS对照,利用蛋白印迹法检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）、环加氧酶-2（COX-2）蛋白的表达以及对IκBα、p-JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）、p38MAPK、p-p38MAPK（Thr180/Tyr182）、ERK1/2、p-ERK1/2的影响。[结果]GLA可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的蛋白表达（P〈0.05）,且在0～50μmol/LGLA浓度范围内存在剂量依赖关系。GLA可以显著抑制IκBα的降解（P〈0.05）,从而抑制NF-κB的激活。GLA可以显著抑制LPS诱导的JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化（P〈0.05）,对p38的磷酸化没有显著的影响。[结论]GLA具有很好的消炎功效。抑制JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化、抑制NF-κB的激活可能是其发挥生物学效应的重要机制。