解淀粉芽孢杆菌在葡萄叶片上的定殖能力研究

为探究解淀粉芽孢杆菌在葡萄叶片上的定殖能力,本研究先后采用利福平和链霉素对解淀粉芽孢杆菌N24进行双抗诱导,获得了菌落特征与野生菌相同且抗药性稳定的双抗菌株(抗利福平320μg/m L、抗链霉素150μg/m L)。此双抗菌株在葡萄叶片上的定殖试验结果表明:浓度为1×104cfu/m L和1×106cfu/m L的菌液喷施叶面后,5~10 d菌量快速增加,10 d达到最高峰,此时其定殖和繁殖能力最强,尤其是起始菌液浓度为1×106cfu/m L时,叶片上的定殖量可达1.7×103cfu/g。浓度为1×108cfu/m L的菌液喷施叶面时,在喷雾后5 d菌量达到最高峰。综合来看,生防菌N24的最适喷施菌液浓度为1×106cfu/m L。添加增效因子后有利于双抗菌株在葡萄叶片表面的定殖,其中,添加壳聚糖的效果最好,其次为苏氨酸。添加磷酸氢二钾后的菌量与对照相比,没有显著差别。     

棉花黄萎病内生拮抗细菌L 4 2的鉴定及定殖

从棉花健株茎内分离筛选到一株棉花黄萎病内生拮抗细菌L-4-2,通过形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolique aciens).通过逐步提高药物质量浓度的方法,获得能在含利福平100 mg/L NA培养基中生长并对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)拮抗活性稳定的L-4-2抗性菌株,测定L-4-2在棉花根、茎内的定殖能力.结果表明,拮抗菌L-4-2能在棉花根、茎内很好地定殖和传导;接种第7天根内的定殖数量达到最大,为2.3×105 cfu/g;接种第14天茎内定殖数量达到最大,为1.6×105 cfu/g;随后在根、茎内的定殖数量有所下降;接种35 d后在棉花根、茎内仍有很强的定殖能力,定殖数量分别为9.6×103 cfu/g和3.24×104 cfu/g.     

枯草芽孢杆菌L1-21在柑橘上的定殖能力及其防治绿霉病效果

为明确枯草芽孢杆菌L1-21在柑橘叶片、果实内的定殖能力及其防治果实绿霉病的效果,通过向柑橘叶片喷施10~6 cfu/mL的L1-21菌株的绿色荧光标记菌(L1-21-GFP)发酵液,测定其在叶片内的定殖数量及传导能力;采用10~8 cfu/mL的菌液喷施和浸泡处理柑橘果实,检测其在果实内的定殖情况,用注射法接种Penicillium digitatum孢子并计算发病率,测定其对绿霉病的防控效果。结果显示,处理后10 min, L1-21-GFP在叶表及叶肉中的定殖量分别达到1.36×10~3和8.08×10~2cfu/cm~2,并呈现持续增长的趋势。处理后1 h, L1-21-GFP向下传导到叶表的菌含量为1.51×10~2 cfu/cm~2,并稳定存在于叶表中;处理后2 h,传导到叶肉的菌含量为5.67 cfu/cm~2,逐渐增加到30 h时的1.15×10~3 cfu/cm~2。L1-21-GFP能在果实内定殖,浸泡1 h果肉和果皮中的定殖量分别为9.51×10~3和3.51×10~4 cfu/g,但在不同柑橘品种果实间定殖能力有显著性差异,椪柑中定殖量最高。浸泡30 min后,L1-21对果实绿霉病防效第3天为100%,第5天为80.36%。以上结果表明,枯草芽孢杆菌L1-21能高效定殖于柑橘叶片及果实内,可以利用该菌株防治柑橘病害。     

钩状木霉与枯草芽孢杆菌在核桃根际土壤中的定殖研究

  目的  植物病害生防菌在植物根际土壤中的定殖情况是影响其发挥生防作用的重要因素之一。近年来,由核桃炭疽病菌引起的核桃炭疽病对云南省核桃产业的发展产生了较为严重的危害,已成为该省核桃产业发展的重要制约因素。前期,通过对大理州漾濞县光明村核桃根际土壤生防菌的筛选工作,获得了具有重要生防潜力的钩状木霉YB-4-15和枯草芽孢杆菌yb33。为了推广上述生防菌株,需首先明确上述菌株在核桃根际土中的定殖情况。  方法  本研究利用不同浓度钩状木霉孢子悬浮液对无菌的核桃根际土壤进行处理,采用定期测定根际土壤中上述生防菌的定殖量。  结果  通过长达一个月的定殖试验,发现钩状木霉在土壤中定殖后的最大量为5 × 104 cfu/g,最小为2 × 104 cfu/g;同时,利用抗利福平枯草芽孢杆菌yb33-Rif在无菌土壤中定殖的最大量为1.08 × 108 cfu/g,最小为7.07 × 106 cfu/g,而在核桃根际土壤中的定殖能力明显低于无菌土,其最大量为7.53 × 106 cfu/g,最小为1.03 × 106 cfu/g。利用上述生防菌钩状木霉YB-4-15孢子和枯草芽孢杆菌yb33菌体浇灌在核桃、桂花、香樟以及石楠等不同根际土壤试验,发现二者在核桃根际土壤中定殖良好。  结论  该研究为这两株生防菌的田间应用提供了理论基础。      

解淀粉芽孢杆菌B10-26对芝麻的促生防病效果及其定殖能力分析

为了确定解淀粉芽孢杆菌B10-26的生防效果与定殖能力,采用浸种法、灌根法、利福平标记法、PCR法等对其促生作用、防病效果、定殖能力、胞外酶活性、抗生素合成酶相关基因进行检测。结果表明,1×10~8cfu/mL的B10-26发酵液对芝麻种子的萌发率及芝麻幼苗的根长、株高和鲜、干质量都有显著促进作用,其中幼苗干质量增加46. 51%; B10-26发酵液与菜豆壳球孢同时接种芝麻幼苗时,防治效果为37. 2%,而在B10-26发酵液灌根7 d后再接种菜豆壳球孢,防治效果达到61. 1%; B10-26菌株具有植株内部定殖能力,在芝麻植株根部定殖量最高,播种后12 d时达到6. 1×10~4cfu/g;胞外水解酶活性检测结果表明,B10-26菌株可以产生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶,不产几丁质酶;对B10-26菌株基因组中抗生素合成相关基因进行检测发现,其具有脂肽类抗生素合成相关基因fenB和srf AD以及聚酮类抗生素合成相关基因baeB。综上,解淀粉芽孢杆菌B10-26具有良好的促生防病及定殖能力,有较好的实际应用价值。     

内生拮抗菌株AC8在甘蓝体内的定殖及其促生效果

为了研究内生拮抗菌株AC8在甘蓝植株体内的定殖及其促生效果,试验通过连续多代抗性筛选,获得了抗利福平300 μg/mL且能稳定生长的菌株.除喷雾法外,浸种法、浸根法、伤茎法、伤叶法均可使AC8菌株侵入甘蓝植株内,并且在根内的定殖能力最强,茎内的定殖能力相对较弱,叶内的定殖能力最弱.在甘蓝的2～3叶期和4～5叶期,与对照相比,AC8菌株处理后的甘蓝植株林高分别增加了27.4％和24.8％,根长分别增加了51.1％和36.1％,鲜重分别增加了19.0％和16.3％,干重分别增加了18.1％和16.7％,反映出AC8菌株对甘蓝有明显的促生作用.     

一株番茄枯萎病生防菌的鉴定、定殖与盆栽防效研究

[目的]从多年种植的大田土壤中分离出一株拮抗番茄枯萎病菌的细菌S-13,对其进行初步鉴定,并测定其定殖能力和防治效果.[方法]16S rDNA系统发育分析初步鉴定菌株种属,利用该菌株的耐受300μg/mL抗利福平的突变菌株,采用盆栽试验和DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析方法,分别测定拮抗菌S-13突变菌株对番茄枯萎病的盆栽防治效果、定殖能力以及对其根际土壤菌群的影响.[结果]S-13菌株初步鉴定为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens GU323369.1)的近似种.盆栽试验表明:灌根组和喷施组在45 d内对番茄枯萎病的发生均具有较好的控制作用,对番茄枯萎病的防效达100;和93;.拮抗菌接种后7、25和45 d的分离培养表明:拮抗菌S-13能够在番茄根际土壤、根、茎、叶中定殖,土壤和根中的定殖数量较高,到第45 d达1.6×105 cfu/g根际土壤和6.6×104 cfu/g鲜根重,但在茎和叶中的定殖并不稳定,到45 d时只在灌根组的叶中检测到有生长为4×102 cfu/g鲜叶重.同时DGGE分析表明S-13在分离土壤是优势菌之一,在接种的第25 d土壤中细菌多样性降低,但在45 d检测时对土壤中细菌的影响逐渐减小,逐步形成一个具有拮抗细菌存在的、稳定的细菌群落结构.[结论]番茄枯萎病菌拮抗菌S-13能够在番茄根际土壤、根、茎、叶中定殖,土壤和根中的定殖数量较高,能够抑制番茄枯萎病的发生及扩散,具有较高的实际应用价值,为进一步的应用奠定了基础,也为番茄枯萎病的生物防治提供了新的选择.     

不同处理方法对内生细菌TS-3在2种蔬菜体内定殖的影响

[目的]了解蔬菜源内生细菌TS-3菌株的生物学效应。[方法]采用涂抹叶片、菌悬液浸种和浇灌3种方法。将利福平（200μg／m1）标记的内生细菌TS-3接种到生菜和甜椒2种蔬菜中,其后测定定殖情况。[结果]采用4×10^5cfu／ml的菌悬液对生菜进行涂抹叶片接种,3d后叶片中菌株数量达到高峰,根中第7天达高峰;在接种甜椒叶片后的第7天,茎和叶中的含菌量均达到最高峰,并稳定在10^4cfu／ml,而根系中舍菌量无明显变化。采用浇灌接种生菜,TS-3菌株在3d后达高峰,在甜椒茎、叶中第9天达高峰,而后该菌的定殖数量稳定在10^4cfu／ml。采用菌悬液浸种,TS-3菌株在生菜叶中的定殖量在1．1×10^4cfu／ml,根中的定殖量在1．5×10^4cfu／ml,而在甜椒中,其定殖量是根〉茎〉叶,但定殖量都在10^4cfu／ml数量级。[结论]鉴于TS-3菌株在2种蔬菜中都能定殖,且不同的接种方法对其定殖量无数量级上的影响,所以采用较简单的浇灌接种方法较好。     

生防菌株白g1在香蕉体内的定殖动态及其促生效果

为了解生防菌株白g1在香蕉体内、根表和根际土壤中的的定殖动态,采用浓度梯度诱导法,获得抗利福平300μg/mL且能稳定生长的白g1标记菌株.通过小区试验,研究分析了该菌株在香蕉植株体内的定殖动态及对香蕉苗生长特性的影响.结果表明:该菌株在香蕉植株体内有较好的定殖能力,在香蕉植株根部、球茎和假茎的定殖量先增长后缓慢下降;接种后60d,分别维持在1.23×102、0.91×102、0.24× 102 CFU/g.根部土壤和根表中标记菌逐渐下降,接种后60d维持在1.29×102、1.13×102 CFU/g.盆栽试验和小区试验表明,该菌对香蕉苗都有明显的促生作用,显著提高了香蕉苗的株高、鲜重和茎粗.     

解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2抗性基因标记及其在作物根部的定殖能力

以质粒pMarA转入解淀粉芽孢杆菌植生亚种B9601-Y2菌株,获得了卡那霉素抗性标记遗传稳定的菌株Y2-pMarA。采用浇灌法、拌种法和浸根法接种大白菜,并用浇灌法接种烟草,观察菌株在大白菜和烟草根部的定殖与消长动态。结果表明:通过10μg/mL卡那霉素的LB平板和PCR方法,证明标记菌株Y2-pMarA均能在植株根际、根表和根内定殖。在播种时浇灌大白菜37d后,在自然土处理中根际土、根表土和根内菌量分别为浇灌7d后菌量的94.31%、95.00%和84.75%,在灭菌土中则分别为75.26%、84.92%和177.74%;在拌种处理大白菜时,自然土处理中根际土、根表土和根内菌量分别为拌种7d后菌量的94.44%、95.27%和61.06%,在灭菌土处理中则分别为75.64%、90.91%和69.06%;在浸根10min后移栽,标记菌株能在大白菜根际土壤中扩散和进入根内;至移栽后33d,自然土处理中根际土、根表土和根内菌株定殖密度分别为6.28×105、9.54×105和4.69×103 cfu/g;灭菌土处理中则分别为6.97×105、1.12×106和1.02×104 cfu/g。     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4定殖促生作用研究

为进一步明确内生生防菌NQ8GⅡ4在宿主和非宿主植物中的定殖能力和促生作用,采用生物学方法测定野生型NQ8GⅡ4菌株的促生潜力;利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的NQ8GⅡ4-GFP菌株,对枸杞、番茄、小麦、西葫芦、生菜和芹菜等6种植物进行灌根处理,利用激光扫描共聚焦显微镜观测NQ8GⅡ4-GFP菌株在宿主和非宿主植物中的定殖情况,同时检测不同接种浓度对枸杞苗生长的影响。结果表明,野生型NQ8GⅡ4菌株在5 d时赤霉素浓度可达16.6μg/mL,并具有一定解磷、产铁载体、纤维素酶和蛋白酶的能力。NQ8GⅡ4-GFP菌株能定殖于枸杞、番茄和小麦的根部,不能定殖于芹菜、生菜和西葫芦。不同植物定殖率有明显差异,在宿主植物枸杞根部定殖率最高,为93.9%,在非宿主植物番茄根部定殖率为91.84%,而在小麦根部定殖率仅为21.43%。不同接种浓度下对枸杞苗生长指标影响不同,其中以10⁵～10⁶ CFU/mL孢子液灌根,对枸杞苗促生作用显著,在农业上具有良好的应用前景。     

哈茨木霉gz-2菌株在土壤中的定殖规律研究

为了明确拮抗木霉在土壤中的定殖动态,采用稀释分离法,测试了木霉gz-2菌株随时间推移在土壤中垂直及水平方向的数量变化情况。结果表明,在垂直方向上,26 cm深度以内,gz-2菌株的定殖数量总体呈先上升后下降的趋势,深度越深,其数量达到峰值的时间越短;深度超过28 cm,其数量不再上升;56 d内,gz-2菌株的最大定殖深度为40 cm。在水平方向上,gz-2菌株呈阶梯式扩散模式,其定殖数量总体呈先上升后下降趋势,并在接种后第35 d达到峰值;63 d内,最大定殖半径为24 cm。土壤含水量和p H对gz-2菌株在土壤中定殖数量的影响测试结果表明,当土壤含水量为25%,pH为7.8时,该菌株在土壤中的数量达到最大值,为3.38×107cfu/g。     

枯草芽孢杆菌BS-208和BS-209菌株在番茄叶面及土壤中定殖能力的研究

对拮抗枯草芽孢杆菌BS-208和BS-209在番茄叶面和土壤中的定殖情况进行了研究。结果表明,在温室和田间条件下,BS-208菌株的定殖菌量分别为11×108～5 6×108cfu/g鲜叶和15×108～0 02×108cfu/g鲜叶,BS-209菌株的定殖菌量分别为222×106～55×106cfu/g鲜叶和205×106～0 48×106cfu/g鲜叶;扫描电镜观察表明,BS-208菌株在番茄叶面分布不均匀,大多定殖于伤口周围、叶面的凹陷处和绒毛的根部;并且都能够在自然土和灭菌土中定殖,自然土中的菌量低于在灭菌土中的菌量。     

3株拮抗菌在水稻植株上的定殖能力及对纹枯病的防效

【目的】研究筛选出的芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB12、伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）SD7、卡特拉链霉菌（Streptomyces katrae）NB20在水稻植株上的定殖能力,以及在离体叶片、苗期和分蘖盛期对水稻纹枯病的防治效果。【方法】NB12和SD7两菌株用利福平（Rif）进行抗药性标记,筛选到抗300 μg/mL Rif 的抗药性菌株用于定殖试验;水稻离体叶片试验用5 mm菌丝块接种,苗期和分蘖盛期试验用带菌谷粒接种。【结果】定殖试验结果表明,SD7和NB12菌株在水稻叶片上能以较高密度定殖,第20天仍能检测到10⁶ CFU/g的标记菌株,且10 d后在新生叶片中也可检测到标记菌株。在离体叶片试验中,NB12、SD7和NB20发酵菌液对水稻纹枯病的防效分别达到91.3%,90.0% 和54.4%,前2个菌株的防效显著高于40 μg/mL的井冈霉素（77.5%）。3个菌株对苗期水稻纹枯病也有较好的防治效果,其发酵菌液防效依次为59.91%,53.73%和38.47%,其无菌滤液也有一定防效。3个菌株对分蘖盛期水稻纹枯病的防治效果不理想,表现较好的NB12发酵菌液和SD7发酵菌液防效也只有17.6%和24.0%,低于井冈霉素的防效（32.9%）。试验中发现,3个菌株的混合处理并没有提高防治效果,反而降低了防效。【结论】NB12和SD7两菌株对水稻离体叶片和苗期纹枯病表现了良好的生防能力,其对分蘖盛期水稻纹枯病的防治效果还需要进一步研究。     

枯草芽胞杆菌R31在香芽蕉根部的定殖能力测定

枯草芽胞杆菌R31在田间和温室对香蕉枯萎病表现出一定防效,为探索其防效产生的机制,利用耐受300 μg/mL利福平和遗传稳定的突变株R31*测定其在巴西蕉和广粉一号粉蕉根际的定殖能力,进行盆栽灌根接种试验.结果显示,每株苗接种50 mL 1.78×108 CFU/mL的菌液,接种后60d,标记菌株在香蕉根际土、根表、根内和球茎中的含量分别为4.14×106 CFU/g(干土)、1.09×107CFU/g(鲜重)、4.66× 104 CFU/g(鲜重)、1.23×103 CFU/g(鲜重);同样处理的粉蕉40d后,根际土和根表的菌量分别为9.87×105 CFU/g(干土),7.9× 104 CFU/g(鲜重).表明突变株R31*在根际土和根表能成功定殖,但在根内和球茎的定殖量则较少,且根际土和根表的定殖量与接种浓度和每天最高气温有关.     

利福平标记菌株BS1在番茄、茄子根部及土壤中的定殖动态

利用生防菌株BS1抗利福平霉素标记法,研究生防菌株BS1在番茄、茄子根部及根际土壤中定殖动态情况,结果表明,BS1可以在番茄、茄子根际土壤中定殖,随着时间的延长,根际土壤菌量逐渐下降,15 d后茄子苗根际土壤菌量及20 d后番茄苗根际土壤菌量均降至0.对BS1在番茄幼苗根部定殖能力研究表明,处理后6 h在幼苗根部定殖的菌量为15 cfu*g-1,12 h后为860 cfu*g-1,24 h后达最大值(7.8×104 cfu*g-1),以后不再增加,48 h后仍维持在较高水平(6.5×104 cfu*g-1).     

GFP标记短小芽孢杆菌LYMC-3在马尾松体内的定殖

为研究松材线虫拮抗细菌短小芽孢杆菌LYMC-3的内生性及其在马尾松体内的定殖规律,采用扫描电子显微镜(SEM)观察菌株在马尾松组培苗体内的定殖,并采用高渗透法将质粒pGFP78转入菌株LYMC-3,对其进行绿色荧光蛋白(GFP)标记,同时测定标记菌株的遗传稳定性.在此基础上,以GFP标记和抗性标记作为示踪手段,将标记菌株接种到2年生马尾松盆栽实生苗的根部,借助激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和稀释涂板的方法,对马尾松根部、茎部的标记菌株进行定期回收检测.结果显示,通过SEM成功观察到菌株LYMC-3在马尾松体内的定殖,并成功获得LYMC-3菌株荧光表达强烈且遗传稳定的转化子,经过连续8次的稀释培养,其遗传稳定性为96.8％.GFP标记菌株在接种马尾松根部后的第4天,根部、茎部都能回收到大量标记菌株的存在,随后呈持续下降的趋势,且根部的下降速度快于茎部.接种40 d后,根部回收标记菌株数量为0.3×102cfu/g,茎部回收标记菌株数量为0.8×102 cfu/g.以上结果表明短小芽孢杆菌LYMC-3具有内生性,能在马尾松体内良好地定殖和传导.     

解淀粉芽孢杆菌FS6在人参体内的定殖特性及对人参诱导抗病性

【目的】明确解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FS6在人参体内的定殖规律及其在病原菌胁迫下对人参防御酶活性的影响,为揭示FS6诱导人参产生抗病性的诱导抗病机制奠定基础,进而为人参根部病害的绿色防控提供依据。【方法】采用抗生素标记法获得FS6菌株抗利福平的突变体菌株,采用灌根和叶面喷雾两种方法接种,研究FS6在人参植株体内及人参根际土壤中的定殖规律;采用灌根法,利用盆栽试验研究不同处理条件下FS6对人参抗病相关防御酶活性的影响。【结果】从含300μg/mL利福平抗性平板上得到标记菌株,该标记菌株能在NA培养基上稳定生长,抗性丢失率为0,且标记菌株与野生菌株的拮抗能力无明显差异。定殖试验结果表明,灌根和叶面喷雾两种接种方式下,FS6~(Rif)菌株均能在人参植株各个部位及根际土壤中定殖,并能在人参体内转移。其中,灌根后FS6~(Rif)在土壤中的定殖量在处理后第1天达到最大值,为4.8×10~3 CFU/g;叶面喷雾后FS6~(Rif)在叶片中的定殖量在处理后第1天达到最大值,为3.2×10~3 CFU/g。FS6发酵液处理后再接种人参根腐病菌,与其他3个处理相比,人参防御酶活性显著提高,CAT、POD和PPO分别在FS6发酵液灌根处理后第12,15和18天达到峰值。【结论】FS6菌株能够在人参植株体内稳定定殖并传导,且能在一定程度上诱导人参产生抗病性。     

拮抗细菌B-916对水稻病原菌的抑制效果及其定殖动态研究

枯草芽孢杆菌B-916是一株能有效防治水稻纹枯病的生防菌,在水稻叶片上定殖能力较强,接种纹枯病菌23 d后,健株上已回收不到B-916,而病株上B-916的数量仍有2×102cfu/m l。     

短小芽孢杆菌BX-4抗生素标记及定殖效果研究

为研究短小芽孢杆菌BX-4在作物根际的定殖及防病效果,通过浓度梯度法用氨苄青霉素对其进行了抗性标记,并通过番茄盆栽试验研究了其在根际土壤中的定殖规律.结果表明,筛选出的突变体菌株BX-4'能够耐受浓度为200 μg·mL-1的氨苄青霉素,并且具有耐药和遗传双重稳定性;应用试验显示该突变体菌株能成功在番茄根际定殖.接种20 d后根际土壤中存活数量达到最高值1.34x108cfu·g-1干土,以后逐渐下降,到50 d时趋于稳定;筛选的突变体菌株对番茄青枯病具有明显的防治效果,防效达37.9%～50.9%.短小芽孢杆菌BX-4在作物根部的定殖规律为揭示其生防机理及应用该菌提供了科学根据.