SAGE技术及其应用

综述了基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression,SAGE）技术的基本原理和最近SAGE技术的应用情况以及在家蚕功能基因研究中的应用前景。     

地黄烯醇化酶基因(RgENO)的生物信息学与表达分析

[目的]研究地黄烯醇化酶基因(RgENO)的生物信息学功能及其表达情况.[方法]利用高通量测序对混合地黄发育块根进行转录组测序,通过基因注释得到地黄烯醇化酶基因(RgENO)序列,RgENO为780 bp,编码260个氨基酸的蛋白质.利用生物信息分析软件对RgENO进行同源性比对、结构、跨膜结构区和信号肽分析;用RT ...     

‘砀山酥梨’果实CCoAOMT基因的克隆与表达分析

[目的]通过克隆‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)果实中咖啡酰-辅酶AO-甲基转移酶(CCoAOMT)基因的全长序列,并对其进行生物信息学及基因表达差异分析,阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用,以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。[方法]以15年生‘砀山酥梨’果实为试材,根据从NCBI数据库中搜索得到关于植物木质化的CCoAOMT基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对,利用RT-PCR技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因PbCCoAOMT,GenBank登录号为KJ577544。[结果]该基因全长1133bp,具有1个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列比对及系统进化树分析表明:CCoAOMT酶是氧甲基转移酶类,与其他植物CCoAOMT编码的蛋白序列有较高的相似性,尤其与枇杷的相似度最高,达到98.79%,且亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对其在果实不同发育时期表达模式的分析发现,基因表达量呈先上升后下降的趋势,与梨果实中石细胞含量的变化趋势相似。[结论]初步认为从‘砀山酥梨’中克隆得到的PbCCoAOMT基因可能参与了梨果实中木质素的代谢。     

绿豆Dof家族基因的生物信息学分析及盐胁迫下的表达分析

[目的]Dof家族基因是植物特有的一类转录因子,在植物的生长发育、细胞的防御反应等方面具有重要的调控作用.[方法]本文从绿豆转录组数据库中筛选出41条Dof基因,对其蛋白序列进行生物信息学分析和盐胁迫下表达分析.[结果]Dof基因分布在除6号染色体外的1～11号染色体上,都具有1个高度保守的结构域;Dof蛋白含有5～2...     

水稻WOX家族基因鉴定及其种子在逆境萌发中的表达分析

【目的】开展水稻WOX基因家族成员的鉴定及在种子逆境萌发中的表达分析,可为探究WOX家族基因的功能、作用机制及水稻遗传改良提供理论参考。【方法】对水稻WOX基因家族成员进行鉴定,利用生物信息学软件对其系统进化关系、理化性质、基因结构、保守结构域、保守基序、顺式作用元件和染色体定位等进行分析,并利用实时荧光定量PCR（q...     

柑橘低氧应答基因CsHRP的克隆、亚细胞定位及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从奥林达夏橙[Citrus sinensis（L.）cv.Olinda]果萼离层中分离出1个低氧应答基因,命名为CsHRP.CsHRP基因的序列分析推测其编码98个氨基酸残基.CsHRP基因组序列与cDNA比对结果表明其含有2个内含子.Blastp分析发现,CsHRP含有保守的低氧应答保守结构域HIG1N,与可可、玉米、橡胶树等植物中的同源蛋白相似度达68%81%.亚细胞定位显示CsHRP是细胞膜/细胞壁锚定蛋白.qRTPCR试验结果显示CsHRP在幼苗子叶中的表达量明显高于根、茎、叶.在逆境处理条件下,CsHRP表达受低温,高盐,PEG6000,脱落酸,乙烯,甲基茉莉酸和水杨酸诱导,说明该基因响应多种信号转导.     

红汁乳菇16个萜类合成酶基因的鉴定与表达

为了解真菌红汁乳菇（Lactarius hatsudake）萜类合成酶（TPS）基因的功能,从红汁乳菇全基因组中分离获得TPS基因,并对其进行生物信息学分析,系统发育树构建,对它们在不同碳源和氮源培养条件下的表达情况进行分析。结果显示：在红汁乳菇基因组中共分离出16个LhTPS基因,LhTPS10、LhTPS13、LhTPS14仅具有萜烯合酶的DXXD保守结构域,其余蛋白均具有DXXD和NSE保守结构域,因此把16个萜类合成酶分成两类。系统发育树将16个LhTPS分为4个大分支,第Ⅰ、Ⅱ分支为倍半萜合成酶,第Ⅲ分支为倍半萜及二萜合成酶,第Ⅳ分支为倍半萜和三萜合成酶,LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16主要生成Δ-6 protoilludene的相似物或者衍生物,LhTPS7主要生成γ-cadinene的相似物或者衍生物;LhTPS10主要生成δ-cadinene的类似物或者衍生物。表达分析表明,不同氮源的培养基培养条件下的表达情况整体上要优于不同碳源的培养基培养条件下的表达情况。在不同碳源及质量浓度培养基中,以10.0 g·L^-1山梨醇培养基...     

鸭LEPR基因结构和功能的生物信息学分析

以鸭瘦素受体(LEPR)基因为研究对象,运用生物信息学方法对鸭等10种动物的LEPR蛋白进行多序列比对分析、分子进化分析及蛋白质结构分析,并预测LEPR蛋白的理化性质、疏水性等基本性质。结果表明：鸭LEPR蛋白预测为不稳定的亲水性蛋白质,不含信号肽,为非分泌型蛋白质,定位在细胞质膜上,与其生物学功能相符。鸭LEPR蛋白还含有132个潜在磷酸化位点、10个N型糖基化位点和6个O型糖基化修饰位点。进化关系分析表明,鸭LEPR基因与同为水禽的黑天鹅进化关系最近,具有较高的同源性。这一研究为进一步研究鸭LEPR基因及其编码的蛋白质结构和功能提供了参考。     

总状毛霉丝氨酸蛋白酶基因结构和功能的生物信息学分析

利用PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)技术从总状毛霉中克隆获得1个丝氨酸蛋白酶新基因,利用生物信息学方法对该基因序列、编码的酶序列以及酶性质和结构进行预测。结果表明:该基因编码区序列长1 421bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码由429个氨基酸残基组成的多肽;对该多肽的组成和进化分析表明,其成熟肽属于蛋白酶K家族的胞外蛋白酶;通过同源建模结构分析表明,该酶没有二硫键,有152个氢键和29个盐键,酶的Glu190、Ala192和Asp215残基与一个Ca2+相结合,酶活性位点残基Asp44和Ser241溶剂可及表面积较大,分别达到0.211 42和3.309 32;该酶的底物结合区域中,S1和S4口袋结构明显,S2次之,S3最不明显,部分组成S1和S4口袋的氨基酸残基不保守,这可能使该酶具有独特的水解性。上述结果可为该蛋白酶基因的异源表达和结构与功能关系等方面的研究提供参考。     

桉树焦枯病菌MDR基因生物信息学分析及功能解析

通过生物信息软件及qPCR对桉树焦枯病菌MDR蛋白的序列特征、蛋白结构、理化性质及MDR基因在不同条件下的表达情况进行分析.结果表明,MDR转运蛋白均由α-折叠、无规则卷曲、β-转角,所占百分比α-折叠β-转角无规则卷曲.三级与二级结构预测均显示桉树焦枯病菌MDR具有典型的MDR蛋白结构,说明该蛋白家族的进化比较保守;CpABCB10基因参与调控分生孢子稳定性和萌发,CpABCB4和CpABCB9基因参与调控金属离子的转运,CpABCB7和CpABCB8基因参与调控桉树焦枯病菌的抗药机制.此外,CpABCB7基因还能参与调控桉树焦枯病菌的整个致病过程.     

葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表达模式与功能分析

【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH）,分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式,研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力,为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材,采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长,并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析;利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性;利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式;同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白,分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致,长度为1 092—1 392 bp,分别编码364—464个氨基酸,与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构...     

大麦MBF1基因的电子克隆与生物信息学分析

通过同源比对,对大麦MBF1s基因进行了电子克隆,并通过生物信息学的方法对其及编码蛋白质进行了预测和分析.结果表明,克隆到大麦MBF1家族3个成员HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c,三者所编码蛋白质均包含典型的MBF1和HLH结构域,无可识别的信号肽和跨膜区,均为亲水性蛋白,含有数个可能的磷酸化位点.电子表达谱结果表明,3个成员在大麦的大部分组织器官中都有表达,而HvMBF1a和HvMBF1b对所分析的胁迫处理响应不明显,HvMBF1c的表达受各种处理的剧烈诱导,HvMBF1c可以作为大麦和其他作物抗逆性分子育种的重要候选基因.     

水稻2个F-box基因的生物信息学分析

对水稻中2个新的F-box蛋白基因Os5h和Os7h进行生物信息学预测分析。试验结果表明,基因序列分析确定Os5h和Os7h是F-box家族的两个基因;启动子预测分析结果表明,这两个基因含有大量的与光反应应答相关的元件,并且也都含有非生物逆境应答元件;对这两个基因进行了转录表达分析和共表达基因的分析,Os5h基因在花中表达最高,胚芽中最低,Os7h基因在根中表达相对其他组织较低,但整体表达相对比较均匀。     

SAGE技术在大豆上的应用

随着功能基因组学研究的兴起 ,基因表达研究的分析方法也在不断发展。而基因序列表达分析技术 (SAGE)是一种以测序为基础 ,采用数字化分析手段 ,在转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的有效工具。该技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞表达的基因 ,获得这些基因表达丰度的数量信息 ,还可比较不同组织、不同时空条件下基因表达的差异 ,从而发现新基因。SAGE技术在农作物方面的应用相对较少 ,但进展很快。笔者着重介绍了SAGE在大豆基因表达分析中的应用 ,简要评述此种方法的原理及优缺点 ,并分析了SAGE所存在的问题、改进方法及发展前景     

奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析

 【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆(U12),其插入片段序列(URE12)全长43 358 bp,GC含量为43.75%,经GeneMark程序预测含有38个基因,经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因(Acc-32)编码159个氨基酸,与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相似度,编码蛋白分子量为17.89 kD,等电点为5.27,在距离Acc-32上游的33 kb区域,发现一段能编码ACCase连接酶的基因。Acc-32的结合位点氨基酸残基为GQVICVIEAMKVFNELKA,系统发育分析表明Acc-32属于ε-变形菌纲。【结论】得到了含有ACCase基因的序列片段,并且ACCase基因具有新的结构特征。     

小麦全基因组中YABBY基因家族的筛选与特征分析

YABBY家族是植物特有的转录因子,在植物侧生器官极性建立和发育过程中起重要的调控作用。从全基因组水平鉴定小麦YABBY家族并进行生物信息学和表达模式分析,为研究小麦YABBY家族基因的功能奠定基础。根据已经报道的拟南芥和水稻YABBY基因,在小麦基因组数据库中执行本地BLAST程序鉴定小麦基因组中的YABBY基因,采用MEGA、GSDS、MEME和PlantCARE等软件进行生物信息学分析,并利用已公开的RNA-seq数据绘制不同发育时期和不同组织的表达谱。结果表明,在小麦基因组范围内鉴定得到18个YABBY基因家族成员,分成5个亚家族。Motif分析表明小麦YABBY蛋白均具有C2C2锌指结构域及YABBY结构域; Ta YABBY启动子区检测到与植物生长发育、激素诱导和逆境胁迫有关的顺式作用元件。RNA-Seq表达谱发现小麦YABBY基因具有明显的组织表达特异性。     

番茄DIR基因家族鉴定及其对非生物胁迫响应的分析

【目的】鉴定番茄DIR基因家族所有成员,并对其基因结构、编码蛋白的理化性质、系统进化、染色体定位、共线性、启动子元件、表达模式、互作转录因子及内源竞争RNA预测等进行了解析,为探究DIR在番茄生长发育和逆境胁迫中的作用提供参考。【方法】采用生物信息学方法,基于全基因组数据对番茄DIR基因家族成员进行鉴定,运用Phytozome、MEME、PlantCARE、opsRNATarget和plantcircnet等在线网站获取染色体位置、保守基序、顺式作用元件、存在互作的转录因子、miRNA和circRNA等信息。利用Mapteace、TBtools、Cytoscape、OmicShare等作图软件及工具绘制染色体定位图、进化树、DIR与转录因子关系图、ceRNA网络等。采用NCBI的基因数据库结合转录组测序及qRT-PCR试验研究DIR基因家族在逆境下的表达情况。【结果】共鉴定到番茄中27个DIR基因,将其命名为SlDIR1—SlDIR27,分别位于12条染色体上,且大部分基因位于染色体末端,其基因结构、基序和结构域相对保守,其中22个SlDIR具有一个外显子的经典结构。番茄DIR基因家族同拟南芥的共线性关系远高于水稻和大豆。基于系统进化关系将27个番茄DIR成员分为3个不同的亚家族。转录组数据表明大部分DIR基因在番茄根部具有较高的表达量。此外,DIR基因的启动子区域含有多个与干旱、低温等非生物胁迫,以及MeJA、ABA、SA等激素诱导相关的顺式作用元件,且预测到与激素、生长发育、非生物胁迫相关的ERF、E2F/DP、MYB等互作转录因子。结合转录组数据分析,分别有5、10、10和13个SlDIR在农药、干旱、盐和冷胁迫后显著上调表达,其中,SlDIR23受到以上4种胁迫的诱导表达,而SlDIR8、SlDIR13和SlDIR20特异性响应冷胁迫的诱导,SlDIR17特异性响应盐胁迫。番茄DIR的ceRNA调控表明,miR-156与靶基因SlDIR8可能共同作用调控番茄的逆境胁迫。【结论】共鉴定出番茄DIR家族基因27个,不均匀地分布在12条染色体上,在根部有较高的表达量。SlDIR1、SlDIR13和SlDIR14等具有MeJA、ABA、SA等激素响应元件,其中,SlDIR6仅具有MeJA元件,SlDIR27仅具有SA响应元件。另外,SlDIR2、SlDIR14、SlDIR23等参与干旱、盐、低温等多种逆境胁迫,其中SlDIR23在不同胁迫处理下均可被激活。此外,DIR基因和转录因子、非编码RNA相互作用,共同参与调控番茄植株的逆境胁迫。     

中华稻蝗羧酸酯酶家族基因生物信息学及组织表达特异性分析

【目的】对重要农业害虫中华稻蝗（Oxya chinensis）羧酸酯酶（carboxylesterases,Ces）家族基因进行生物信息学分析,并对部分基因的组织表达特性进行研究,为揭示中华稻蝗Ces基因功能及研发新的分子靶标提供依据。【方法】基于中华稻蝗转录组数据库,通过关键词搜索获得Ces基因序列,采用生物信息学方法进行比对拼接、氨基酸序列推导和开放阅读框分析,选择全长序列构建系统发育树,采用在线软件分析中华稻蝗Ces氨基酸序列结构、理化性质、信号肽和N糖基化位点等特征。采用实时定量PCR技术,通过geNorm 与Normfinder 软件分析4个候选内参基因β-肌动蛋白（β-actin）、延长因子（EF1α）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和核糖体蛋白49（RP49）表达稳定性,筛选中华稻蝗5龄若虫不同组织部位最适内参基因并检测10个羧酸酯酶基因在不同组织部位相对表达量。【结果】从中华稻蝗转录组数据库搜索获得Ces基因cDNA片段180个,经筛选获得28个Ces基因全长序列进行生物信息学分析。推导的氨基酸序列与其他昆虫物种的聚类分析结果显示,中华稻蝗28个Ces分布于4个功能簇中,其中A簇直翅目和部分双翅目昆虫α酯酶（20个）、D簇表皮特异酯酶（2个）、E簇β酯酶（4个）和F簇非鳞翅目保幼激素酯酶（2个）。氨基酸序列分析结果显示,中华稻蝗大部分Ces的等电点（pI）均为偏酸性或弱酸性,pI为4.38-6.84,只有3个Ces的pI值偏碱性。中华稻蝗所有的Ces基因都具有N糖基化位点、N端保守的半胱氨酸残基及氧离子洞,信号肽预测结果表明19个Ces具有完整的信号肽;21个Ces具有典型的催化三联体S-E-H,其余7个Ces催化三联体发生了不同的替换。GeNorm与Normfinder分析结果显示,4个候选内参基因稳定性EF1α=RP49＞β-actin＞GAPDH。选择EF1α作为内参基因,RT-qPCR结果显示10个羧酸酯酶基因在7个不同组织部位均有表达,其中OcCesA1、OcCesA6、OcCesA12、OcCesA14、OcCesA18和OcCesA19在中肠和胃盲囊高表达,此外OcCesA6、OcCesA18和OcCesA19还在马氏管高表达,OcCesA2在后肠高表达。OcCesD1在马氏管表达量最高,脂肪体和表皮次之;OcCesE1在胃盲囊表达量最高;OcCesF2在中肠表达量最高。【结论】基于中华稻蝗转录组数据库获得28个全长Ces基因,聚类分析结果显示,这些基因分布于4个功能簇中,其中分布于A簇的基因数目相对较多,且多在中肠、胃盲囊和马氏管等代谢解毒器官中高表达。研究结果为Ces基因功能的深入探索和中华稻蝗Ces基因分子靶标研发提供了依据。     

植物功能基因选择性剪接研究进展

选择性剪接是基因表达调控的重要机制,在植物发育、抗病和应对环境胁迫等方面起着重要的作用。近年来,新一代测序技术在植物基因组和转录组测序领域得到广泛应用,植物选择性剪接研究取得了一些新进展。本文就此进行了综述,包括选择性剪接占植物功能基因的比例、选择性剪接的类型及其调控机制等内容,并提出了今后植物上的研究重点应放在选择性剪接的功能方面。     

小果野蕉microRNAs及其靶基因的生物信息学预测

通过基于表达序列标签（EST）、基因组勘测序列（GSS）和高通量测序基因组序列（HTGS）的同源序列比对搜索,以及一系列的标准筛选,最终预测到属于8个家族的10条小果野蕉miRNAs。在线软件psRNATarget预测到24对miRNAs与靶基因的互作,这些靶基因主要参与小果野蕉的新陈代谢、生长发育以及胁迫响应等过程。