基因枪法向甘蓝型油菜转移反义FAD2基因的研究

为了获得高油酸油菜品种,以湘油15号子叶柄为受体材料,用基因枪法,将反义油酸脱饱和酶FAD2基因连在种子特异表达载体上后导入油菜,使用可裂膜压力7700kPa,样品室真空度9.5×104Pa,质粒质量浓度为1.0μg/μL,靶距9cm,通过对子叶柄的预处理48h,高渗处理1h,获得8株再生植株.经PCR与PCR-Southern杂交检测,其中有2株为转化株,证明反义FAD2基因已整合到湘油15号基因组中.     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因，即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA，经RT—PCR反应，扩增出723bp和569bp的目的片段，将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上，测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切，将基因反向插入PROK2表达载体上，构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切，将基因反向插入PROK2表达载体上，构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

蝴蝶兰ACC合成酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

［目的］克隆蝴蝶兰ACC合成酶cDNA片段，构建其反义表达载体。［方法］根据已报道的蝴蝶兰ACC合成酶的基因序列，设计并合成了1对引物，通过RTPCR以蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC合成酶的cDNA片段，将其连接到MD19T质粒载体上进行测序。用XbaⅠ和SacⅠ对重组质粒和pBI221酶切后连接，构建蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结果］获得了蝴蝶兰ACC合成酶的cDNA片段，测序结果显示，该片段与参考的已报道序列具有98.92%和76.36%的同源性。通过引入XbaⅠ和SacⅠ酶切位点，进行载体构建，构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结论］成功构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因植物表达载体，为进一步研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础。     

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的cDNA片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生中克隆获得编码PEPCase基因的cDNA片段(886 bp),测序结果显示其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%、84.37%、81.54%、81.25%、78.71%.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体.     

降低木质素、提高抗逆性的无标记植物表达载体的构建

采用高保真酶用PCR方法从pM018-BADH载体上扩增出目的基因BADH，替换pBI121质粒中的gus基因，构建pBI121-BADH植物表达载体。经过2对引物检测，证明pBI121-BADH载体构建正确。又从pBI121-BADH质粒中扩增出35s—BADH-nos片段，所用引物加上了Nhe I和Cla I接头，扩增片段经回收后插入到pUCm—T载体中测序。测序表明，所扩增的35s—BADH—nos片段与模版同源性为100％。将测序正确的质粒pUCm-35s—BADH-nos用Nhe I和Cla I酶切后连接到进行了相同酶切的pBI121-xylA载体上，用35s—BADH—nos片段取代pBI121-xylA载体上的npt Ⅱ基因片段，构建pBI121-xflA-BADH双元植物表达载体，该载体经PCR检测和酶切检测，与预期结果相同。最后，用Pme I、Cla I从pBI121-xylA—BADH上切出片段35s—BADH—nos，将其连接到进行了相同酶切的pt4CL1-P载体上，使35s—BADH-nos片段取代pt4CL1-P载体上的npt Ⅱ基因片段，构建了无选择标记的反义4CL—BADH植物双元表达载体。     

水稻OsGL1-2基因反义表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增水稻OsGL1-2基因反义片段及基因自身的启动子,并分别克隆到pUC19克隆载体上,得到含有OsGL1-2启动子＋OsGL1-2反义片段的中间载体.对重组子进行PCR检测和酶切分析并测序,结果表明,长度分别为417和2 199bp.将OsGL1-2启动子＋OsGL1-2反义片段克隆到植物表达载体pCambia1380多克隆位点,构建了该基因的植物反义表达栽体pCamGL1-2.     

加工番茄PG基因片段的cDNA克隆及表达载体构建

从加工番茄红熟果实中提取总RNA,根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的序列设计合成一对特异引物,经过反转录PCR,扩增出一条697bp的目的片段。通过TA克隆,把它连接到pMD18-T vector上,测序鉴定其正确性。扩增片段经Sal I和Sma I双酶切插入到表达载体pBinAR CaMV 35S启动子和OCS终止子之间,用M13测序引物和目的片段引物进行PCR扩增鉴定,构建成含有PG基因片段的反义表达载体pBinAR-aPG,为进一步对加工番茄的遗传转化奠定了基础。     

油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响

 【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384 bp的片段，将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中，构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1，通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中，【结果】获得3棵转基因植株，PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量，结果表明：与非转基因对照相比，转基因植株的BnWRI1基因均受抑制，种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默，表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。     

卷首语

<正>本期以下4篇论文值得关注:国家油菜改良中心付三雄博士采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一种油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶基因。试验通过设计引物克隆了丙酮酸激酶基因的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Notl和Xhol酶切,酶切产物连接到新近改造的RNAi平台载体的Notl和Xhol位点,利用多重PCR技术证实载体构建成功,然后将丙酮酸激酶基因反向重复框克隆到加入启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的丙酮酸激酶基因的RNAi载体。     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。     

油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建

丙酮酸羧化酶（ Ｐ Ｅ Ｐ）是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶⒚本研究用 Ｐ Ｃ Ｒ 法扩增出了 Ｐ Ｅ Ｐ 基因片段,并将其 克隆到 ｐ Ｂ Ｓ Ｓ Ｋ＋ 的 Ｓｍ ａ Ⅰ位点⒚ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析表 明克隆片段 的长度为 ５３０ｂｐ,其序列与报道序列相同⒚将该 Ｐ Ｅ Ｐ基因 片段反向插入 ｐ Ｉ Ｇ１２１ 质粒,构建了带 Ｐ Ｅ Ｐ 反义基因的超级双元载体并进行油菜的转化,目前已获得转基因植株⒚     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因正反义表达载体的构建

为了改善甜瓜果实的品质及研究甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的生物学功能,本试验分别构建了甜瓜果实SPS基因的正义及反义表达载体。用PCR方法将克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用带有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增,然后将该扩增片段克隆到pMD19-T Simple载体上,再用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切,得到该基因编码区3.37 kb的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/XbaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的正义表达载体。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用KpnⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区830 bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。     

拟南芥2A6基因正义、反义植物表达载体的构建

利用PCR技术从番茄基因组中扩增了长约1.1kb的E8基因启动子,构建了中间表达载体pCAMBI-AE8;利用RT-PCR方法从拟南芥中扩增了长约1 197bp的2A6基因全长cDNA编码区,将其定向插入pCAMBI-AE8,构建了正义植物表达载体pCAMBIAE8-2A6;同时扩增了长约500bp的cDNA片段,定向插入pCAMBI-AE8,构建了反义植物表达载体pCAMBIAE8-2A6anti.以此为基础,可以进一步研究2A6基因的差异表达对转基因拟南芥角果发育的影响,达到揭示2A6基因功能的目的.     

野猪肌细胞生成素基因的克隆与序列分析

参考家猪(X89007)MyoG基因序列设计2对特异引物,用PCR方法首次从野猪基因组中扩增出2个大小分别约为1.6 kb和1.0 kb的DNA片段,其PCR产物经pMD-18T载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。DNA测序和序列拼接表明:野猪肌细胞生成素基因DNA序列长2 466bp,含完整的3个外显子和2个内含子,与家猪、牛、马、狗、小鼠和人的MyoG基因的cDNA序列同源性分别为99.8%、92.4%、92.7%、89.7%、90.8%和94%,其cDNA编码氨基酸序列与家猪、牛、马、狗、小鼠和人的同源性分别为100%、96.4%、95.9%、94.1%、96.4%、96.8%;对野猪MyoG基因组序列与9个家猪品种的相应同源序列进行比较,检出16个核苷酸变异位点,且其中有5个为家猪中不具有的新变异位点,其变异位点主要发生在内含子部分,尤其是内含子1中的变异位点比例最大(11个)。这些结果表明,野猪肌细胞生成素基因的编码序列在进化过程中是高度保守的,而内含子部分尤其是第1内含子具有丰富的序列多态性。对117个限制性酶切位点扫描分析发现,野猪MyoG基因核苷酸序列中含有78个酶切位点,其中有5个酶切位点包含变异位点,尤其是1 153位点的T突变成G所产生的SmaI(CCC/GGG)或XmaI(C/CCGGG)酶切位点为野猪所特有。所测DNA序列已提交到GenBank中,获得的序列号为:FJ356697。     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

以大肠杆菌(Escherichia coli)W3350菌株总DNA为模板,根据已报道的几种生物的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因(mtlD)序列设计引物,通过PCR扩增到1条长约1.15 kb的特异片断,把该片断连接到pUCm-T载体上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长1149 bp,共编码382个氨基酸,与报道的mtlD基因修正序列完全一致。将该基因插入到原核表达载体pET28a(+),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,发现在约45 kD处明显比对照多出1条带,凝胶扫描后经Bandscan 5.0软件分析表明,该特异条带的蛋白含量占菌体可溶性总蛋白的72.9%。Western blot检测其为带组氨酸标签的融合蛋白,而质谱分析证实其为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。转化子的耐盐能力比对照提高了约20%。该基因提交到GeneBank数据库,返回的接受号为DQ660889。     

薄皮甜瓜果实ACC合成酶cDNA克隆及反义表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(Cucumis melo cv.Qitian I)果肉组织中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到0.7 kb的cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。测序表明,该基因为777 bp,编码258个氨基酸,与Gen-Bank中甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因比对,核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为98%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pCAM2301的E8启动子和NOS终止子之间,构建成E8调控下ACS基因反义表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。