猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

脂质体LTX介导高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)条件的优化

探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、质粒DNA用量、脂质体与质粒DNA比例、脂质体-DNA复合物与细胞作用时间进行优化,荧光显微镜下统计转染后24h的转染效率。结果显示：在24孔培养板中,每孔接种细胞6×104个,24h后进行转染,质粒DNA每孔0.6μg,脂质体与质粒DNA比例为4.5：1.0,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6 h时,转染效率最高,达到81.2％。     

脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究

采用Lipofectin阳离子脂质体介导质粒DNA转染藏鸡成纤维细胞,通过优化重组质粒转染细胞的各种参数以寻求最佳的转染条件。结果表明:6孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时,用2μL脂质体介导1.5μg重组质粒转染10 h即可获得较满意的转染效率。说明Lipofectin能有效介导质粒pEGFP-N3转染藏鸡成纤维细胞,转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。     

西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离与培养

[目的]以西藏黄牛胎牛为材料,建立西藏黄牛胎儿成纤维细胞系,为在西藏特殊生境条件下高原物种的动物克隆及其他细胞生物学研究提供理想的生物学材料。[方法]对西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法成功分离培养西藏黄牛胎儿成纤维细胞,对细胞的传代培养、形态学和动力学进行观察与分析。[结果]所建立的西藏黄牛胎儿成纤维细胞系具有典型的成纤维细胞形态;西藏黄牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0-2 d、2-7 d、7-8 d,细胞群体倍增时期为60 h。[结论]成功培养了西藏黄牛胎儿成纤维细胞。     

西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离与培养

对西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究.利用组织块法和酶消化法均能成功分离培养西藏牦牛胎儿成纤维细胞,通过细胞的传代培养、形态学和动力学观察与分析,结果表明,所建立的西藏牦牛胎儿成纤维细胞系具有典型的成纤维细胞形态;西藏牦牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0～2 d、2～7 d、7～8 d.试验结果表明,已成功培养了西藏牦牛胎儿成纤维细胞.     

梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化

为开展目标蛋白质在梅花鹿耳成纤维细胞的功能研究提供理论和技术依据,培养梅花鹿耳成纤维细胞,优化脂质体转染梅花鹿耳成纤维细胞的条件,以获得最优质粒转染参数。采用组织块贴壁法和差速贴壁法分离梅花鹿耳成纤维细胞,观察细胞基本形态特征变化,免疫荧光法鉴定波形蛋白（Vimentin）的表达;以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为标记基因,利用LipofectamineTM 3000介导外源DNA转染梅花鹿耳成纤维细胞,探讨质粒DNA与脂质体比例（1.0∶1.0,1.0∶1.5,1.0∶2.0,1.0∶2.5,1.0∶3.0）、质粒用量（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5μg）、细胞传代次数（第2～6代）、细胞初始接种密度（50%,60%,70%,80%,90%）、转染效果观测时间（12,24,36,48,60 h）对转染效率的影响。结果表明：组织块贴壁法培养的梅花鹿耳成纤维细胞在倒置荧光显微镜下可见长梭形细胞生长,细胞免疫荧光检测波形蛋白（Vimentin）的表达结果为阳性;筛选的最佳转染条件：当质粒DNA与脂质体比例为1.0∶2.0,质粒DNA用量为1.5μg,细胞传代次数为第3代,细胞初...     

电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化

以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响.结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著.不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率.质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8％.     

延边奶山羊耳成纤维细胞体外培养的研究

为了给延边奶山羊转基因核移植及乳腺生物反应器研究提供足够且状态良好的细胞,采取延边奶山羊耳部组织块,利用组织块贴壁法进行原代培养和传代培养,对于纯化了的成纤维细胞观察其生长状态,并对4代以后的成纤维进行生长曲线、核型分析,并对细胞进行冷冻复苏试验,检测细胞活力.结果表明,4～13代体外培养成纤维细胞的细胞形态及核型基本正常,13代以后,细胞染色体变异比例增加,15代以后,细胞生长速度减慢;冷冻复苏后的细胞除生长速度减慢外,其它细胞生物学特征均正常,基本符合体细胞克隆、转基因等试验的基本要求,可以用于试验研究.     

LipofectamineTM和Fugene-6介导GFP基因转染绵羊胎儿成纤维细胞的比较研究

分别用Lipofectamine^TM和Fegene-6介导质粒pEGFP-C1转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞（sheepfetal fibroblast cells,sFFCs）,比较了DNA浓度、转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响,通过含G418的DMEM/F12培养液筛选得到转基因单克隆细胞。结果表明脂质体转染试剂Lipofectamine^TM转染效率优于Fegene-6。另外,对转基因细胞进行了染色体核型分析。结果表明,转基因细胞中二倍体核型占74.5%,与对照组比较没有显著性差异。以上研究为其他基因转染sFFCs以及利用体细胞克隆法生产转基因绵羊提供了参考依据。     

豚鼠胎儿成纤维细胞的分离培养及生物学特性分析

为建立豚鼠成纤维细胞系，分离培养豚鼠胎儿成纤维细胞，并对其进行细胞活力、生长曲线、细胞周期及基因转染等分析。结果表明，豚鼠胎儿成纤维细胞在10代以内时形态良好，随着传代次数的增加，梭型细胞有拉长趋势，至第20代时梭形明显拉长，单位面积细胞数目大量减少。同时，细胞冻存后复苏贴壁情况良好。EGFP基因转染的成纤维细胞形态特征及生长状态与未转染细胞相似，转基因细胞和未转基因细胞的生长曲线均为S形，符合体外培养细胞正常生长增殖规律。以流式细胞仪分析逆转录病毒介导的EGFP基因转染细胞，可见染色体核型仍为二倍体，说明感染的细胞保持其遗传稳定性。流式细胞仪检测转染后不同时间点收集的病毒液感染的细胞效率，结果显示，病毒转染48 h、72 h收集病毒液组感染效率分别为16.9%和11.6%，显著高于24 h收集病毒液组(0.9%)。     

山羊成纤维细胞体外培养研究

分别采用组织块法与消化法对山羊耳成纤维细胞进行原代培养,比较两种方法的培养效果.结果表明,组织块法培养的细胞生长稳定,5～7d有细胞生长,15～18d长满单层;消化法培养的细胞,通过简化酶作用时间及用量的调控,可得到较为单一的成纤维细胞,且经过4～7d生长后能形成单层.同时对细胞培养过程中常遇到的污染问题及解决方法进行了探讨,为动物组织培养研究提供了实验依据.     

猪耳成纤维细胞的体外培养及EGFP基因的转染

优化脂质体Liperfectamin 2000转染EGFP(加强型绿色荧光蛋白)至猪耳成纤维细胞的参数,如DNA和脂质体的用量、细胞汇合度、细胞暴露于DNA和脂质体复合物的时间。试验显示:24孔板内1.0μgDNA和2.4μL脂质体的用量转染效率最高,DNA和脂质体过量会对细胞产生毒性,影响转染效率;细胞汇合85%~90%才能得到较高的转染效率;细胞暴露4h转染效率最高,时间过长反而使转染效率下降。     

人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。     

陕北白绒山羊Lhx2毛囊表达载体构建及转染成纤维细胞的研究

以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.     

山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养

将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L FBS相     

体外培养山羊成纤维细胞系方法的建立

用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。     

脂质体介导FecB基因转染太行山羊精子的研究

以太行山羊为研究对象,探索精子作为外源基因载体建立转FecB目的基因山羊的可行性,以及脂质体对转染效率的影响.采用共培养与阳离子脂质体介导2种方法转染精子,用原位杂交等技术检测FecB目的基因片段在精子中的存在及存在部位,并对2种方法进行分析.结果表明:太行山羊的精子具有主动捕获外源基因的能力,共培养法精子阳性率为18...     

山羊表皮干细胞的分离培养及EGFP基因转染研究

采用组织块法和酶消化法对山羊表皮干细胞进行分离,对分离的表皮干细胞进行了免疫组化染色鉴定,并对其进行了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染研究。结果表明,2种方法均能得到山羊表皮干细胞,其中组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均为8 d,且培养季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响;酶消化法周期短,8 d左右即可传代,不同培养季节对细胞克隆形成时间、细胞传代时间和传代数无显著影响,但处理过程繁琐。EGFP基因在转染表皮干细胞24 h后大量表达,转染率达20%~30%,72 h时转染强度最大,荧光可持续5周;转染使细胞增殖能力明显下降。     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。