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相似文献
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1.
袁亮  纪耀坤  张伟彬 《安徽农业科学》2010,38(14):7189-7190,7203
[目的]研究T1083替换融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母的自激活实验,探讨其表达产物是否可作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[方法]将T1083替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母后,进行自激活和蛋白表达毒性检测试验。[结果]该片段表达产物无自激活特性且对酵母细胞无毒性,可以作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了实验基础。  相似文献   

2.
[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶(Leucine rich repeat receptor protein kinase) OsRPK1胞外结构域的互作蛋白.[方法]以日本晴水稻为研究材料,以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD(969 bp).将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-OsRPK1-OD.[结果]对pGBKT7-OsRPK1-OD进行毒性检测和转录自激活鉴定,酵母生长结果发现,含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold细胞,在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-gal/AbA固体培养基上生长受到抑制;在SD/-Trp生长出含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致,显示插入的OsRPK1-OD对酵母生长无毒性作用.[结论]OsRPK1-OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质.  相似文献   

3.
[目的]扩增烟草NtKRP基因尾部含T1083替换的片段,将其克隆入pGBKT7载体中。[方法]以pBI121KE质粒为模板进行PCR反应,将得到的PCR产物凝胶回收后等摩尔混合,取适量作为模板,得到含定点突变的尾部片段。将该PCR产物克隆入SmaI线性化的pUC19载体,构建含T1083替换的重组子pUC19Ts。通过蓝白斑筛选得到的重组子进行BamHI -SmaI双酶切鉴定,将筛选出的正确重组子送交联合基因测序。将pGBKT7和测序正确的pUC19Ts质粒均用BamHI -SmaI双酶切,分别回收1 320 bp的融合片段和7.3 kb的载体片段进行连接,转化并筛选得到重组子,任意挑取2个单菌培养后提取质粒进行BamHI -SmaI双酶切鉴定。[结果]成功构建了NtKRP尾部含T1083替换的BD融合质粒载体pGBKT7-TS。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了实验基础。  相似文献   

4.
纪耀坤  张伟彬  袁亮 《安徽农业科学》2010,38(13):6658-6659,6685
[目的]构建T1083替换NtKRP尾部BD融合载体pGBKT7-Ts。[方法]以pBI121KE质粒为模板,通过重叠PCR扩增烟草NtKRP基因尾部含T1083替换的片段,将其克隆入pGBKT7载体。[结果]成功构建了T1083替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-Ts。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了实验基础。  相似文献   

5.
兰兆吉  吴国江 《安徽农业科学》2008,36(17):7150-7151
[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。  相似文献   

6.
目的:用人蛋白激酶CK2α’(hCK2α’)cDNA片段构建酵母双杂交体系中“诱饵”载体。方法;通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pThCKA’获得人CK2α’亚基编码区cDNA,将PstⅠ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7,转化感受态细胞DH5α获得转化子.琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子,将阳性克隆进行限制性内切酶酶切与DNA测序的方法鉴定。将DNA测序验证的pGBKT7-hCK2α’转染感受态酵母株AH109.Westernblot签定hCK2α’蛋白表达.检测表达产物对报道基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性。结果:限制性酶切结果表明,插入片段和重组质粒的大小与理论值推测值相符。重组质粒pGBKT7-hCK2α’转染的酵母株AH109中能够表达hCK2α’蛋白,pGBKT7-hCK2α’无自主激活报道基因的能力及对酵母的生长无毒性。结论:pGBKT7-hCK2α’酵母双杂“诱饵”载体构建获得成功,可应用于酵母双杂交体系。  相似文献   

7.
为构建小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体,并检测其对酵母细胞的自激活作用.利用RT-PCR扩增Ta Trx-h基因的ORF区域,并与pGBKT7载体连接构建诱饵载体pGBKT7-Trx-h,利用PEG/LiAC法转化酵母AH109后,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无自激活作用.结果表明,含pGBKT7-Trx-h质粒的酵母在SD/-Trp-Leu培养基上能正常生长,说明诱饵载体表达产物对酵母细胞无毒性作用;在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上不能生长,说明诱饵质粒无自主激活报告基因的作用.因此,可以利用该诱饵载体通过酵母双杂交方法筛选与Trx-h蛋白相互作用的蛋白.  相似文献   

8.
为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础.  相似文献   

9.
应用酵母双杂交体系,构建凡纳滨对虾IHHNV 3个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体,并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测,为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾IHHNV病毒3个开放阅读框的基因片段进行PCR特异性扩增,并运用In-Fusion技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7进行连接,获得重组质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2,并进行自激活和毒性检测。结果表明,pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2等3个重组质粒对MEL1报告基因无自激活性;对AUR1-C报告基因无自激活作用,pGBKT7-CP,pGBKT7-NS1,pGBKT7-NS2和空载体的酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD_(600)均大于0.8,说明诱饵载体无毒性且不具自主激活报告基因的功能,所获得的无自激活作用的诱饵载体可用于酵母双杂交试验。  相似文献   

10.
张月娟  万一  陈华民  张琨  赵廷昌 《安徽农业科学》2011,39(19):11512-11513
[目的]构建诱饵载体pGBKT7-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性。[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测。[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确。自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用。[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cD-NA文库筛选奠定基础。  相似文献   

11.
为研究At4g05060基因功能,采用PCR扩增拟南芥VAMP(vesicle-associated membrane protein)家族基因At4g05060的ORF序列,定向克隆至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7,经酶切鉴定并测序后将其转化至酵母Y187细胞;然后采用Western blotting技术分析At4g05060基因在酵母中的表达水平,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。结果表明,成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-At4g05060,并在酵母细胞正确表达,表达产物对报告基因无自激活作用。  相似文献   

12.
BmNPV DNA解旋酶基因酵母双杂交诱饵载体的构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
为了筛选家蚕对BmNPV DNA解旋酶的受体基因,根据GenBank公布的BmNPV (T3株)的序列,设计引物对其DNA解旋酶基因的核心结构域进行PCR扩增,成功克隆该基因并利用双酶切亚克隆至酵母双杂交诱饵载体PGBKT7.实验证明重组诱饵载体不能自激活,可以作为诱饵进行蛋白结合试验.  相似文献   

13.
采用TRIzol法提取绵羊卵巢组织总RNA,运用RT–PCR技术扩增绵羊微管解聚蛋白基因(STMN1)的编码区序列;通过同源重组技术构建重组诱饵表达载体pGBKT7–STMN1,鉴定该诱饵蛋白在酵母双杂交系统中的自激活活性、细胞毒性和表达情况;利用诱饵质粒pGBKT7–STMN1从绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交cDNA文库筛选互作的宿主蛋白。结果显示:成功构建重组诱饵质粒pGBKT7–STMN1,并对酵母细胞无自激活活性和细胞毒性作用,且能在酵母细胞中正常表达;筛选获得12个与STMN1相互作用的克隆,经测序比对分析和点对点验证,得到CREB和FOXM1共2个互作的宿主蛋白,这2个蛋白可能参与调控细胞的增殖、周期、凋亡等过程。  相似文献   

14.
[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。  相似文献   

15.
对小鼠朊蛋白(prp105—125缺失)的基因片段进行扩增,并将扩增片段导入诱饵载体pSos中构建酵母双杂交诱饵载体pSos-prp朊蛋白(prp105—125缺失),用重组质粒转化感受态酵母菌cdc25H,检验其表达产物在酵母细胞中有无毒性及自激活作用。序列分析结果表明,该试验成功构建了小鼠朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体,且该诱饵质粒的表达产物对酵母菌cdc25H既无毒性也无自激活作用。  相似文献   

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