利用cDNA-AFLP分析内生解淀粉芽胞杆菌 Fy11诱导辣椒差异表达基因

【目的】分析内生解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Fy11诱导辣椒（Capsicum annuum）幼苗差异表达基因,了解辣椒与内生芽胞杆菌互作的分子机制。【方法】利用cDNA-AFLP技术,采用256对引物,分析辣椒幼苗接种内生解淀粉芽胞杆菌Fy11后5个时间点的基因表达谱;利用qRT-PCR分析差异基因表达模式,验证cDNA-AFLP表达谱。【结果】256对引物共产生18 620个转录本（TDF）,筛选获得353条差异表达条带,占扩增条带总数的1.89%。经克隆、测序分析,最终获得257个差异TDF,聚类分析得到229个独立基因（EST,unigenes）,其中144个基因上调表达,85个基因下调表达。经Blastx比对和功能分类分析,其中65条EST（28.38%）未找到同源性匹配,8条（3.49%）与未知功能蛋白同源性较高。其余156条EST主要涉及基础代谢基因（10.92%）;与能量和抗病与防御类相关基因,各占8.73%;信号转导基因占7.42%;转运子或转座子基因占6.99%;与细胞结构相关基因占6.55%;参与转录调控基因占5.68%;细胞生长类基因占3.93%;参与蛋白质运输和储存有8个基因,占3.49%;蛋白质合成类基因占2.18%;次生代谢类和胞间运输类基因,其数量相对较少,各占1.75%。选取与抗病防御、转录调控及信号转导类等相关的10个差异基因,qRT-PCR分析结果显示其表达模式符合cDNA-AFLP表达谱。【结论】内生细菌与植物互作的分子机制涉及植物多方面生理生化反应,包括抗病防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、以及非生物胁迫等多种途径相关基因的协同控制。     

利用cDNA-AFLP技术鉴定菊花品种‘紫荷’的抗白锈病相关基因

【目的】筛选菊花中抗白锈病相关基因,研究菊花抗白锈病的分子机理。【方法】以菊花中对白锈病完全免疫的品种‘紫荷’为供试材料,对其叶片喷施106个白锈病冬孢子/mL蒸馏水,处理时间梯度为0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h,使用cDNA-AFLP技术分析这一接种过程中的差异表达基因,并采用RT-PCR方法对表达结果进行验证。利用RACE技术克隆其中重要蛋白基因的cDNA全长,采用MEGA 4.0程序进行序列分析。【结果】利用76对引物组合,共筛选出了约4 950条差异表达的cDNA片段,对其中80个表达差异显著的片段进行测序,最终得到51个差异片段的核苷酸序列。Blastx同源性比对发现,其中18个序列与已报道的抗病基因具较高同源性,其功能涉及到抗病、信号转导、光合作用和光呼吸、反转录转座子以及植物基础代谢。RT-PCR验证结果表明,利用cDNA-AFLP技术获得了稳定表达的序列;使用RACE技术获得了其中两个编码植物14-3-3蛋白的基因：CmGFR01、CmGFR02的cDNA全长序列分别为1 062 bp和1 098 bp,分别编码含260和271个氨基酸残基的开放阅读框。对序列进行分析发现,CmGFR01、CmGFR02属于高等植物中一类新的14-3-3基因亚家族。【结论】构建了菊花品种‘紫荷’在白锈病胁迫下的基因表达谱,从基因组水平上识别了一批与抗白锈病相关的基因,这些基因有助于解析植物抗白锈病的分子机理。分离得到的CmGFR01、CmGFR02可用于栽培菊花抗白锈病的分子育种。     

明尼2761抗秆锈病相关基因的cDNA-AFLP分析

【目的】分析中国重要辅助鉴别寄主明尼2761经小麦秆锈菌诱导后的基因表达谱,寻找与其抗病基因表达相关的片段。【方法】运用cDNA-AFLP技术研究明尼2761和感病对照Thatcher分别接种小麦秆锈菌后的基因表达差异,对与明尼2761抗病相关的特异表达片段进行分析。【结果】140对AFLP引物组合能够检测到约7 000多条差异表达转录衍生片段（TDF）,平均每一对引物可以获得50条条带,其中有86对引物能够在明尼2761和Thatcher之间扩增出差异条带。对可能与抗病相关的35条特异TDF进行克隆测序,经BLASTx比对,30条TDF在数据库中能够找到同源序列,其中24条TDF功能已知,6条TDF功能尚未明确。【结论】8条与编码激酶结合蛋白、NBS-LRR抗病蛋白、类肉桂酰-CoA还原酶2b、类肉桂酰辅酶A还原酶2c、蔗糖磷酸合成酶7、类蛋白酶metacaspase 1、类锌指蛋白、假定的类RGA4抗病蛋白基因有较高同源性的TDF应与明尼2761的抗秆锈性相关。     

cDNA-AFLP法筛选红树植物盐应答基因

 【目的】分析红树植物盐胁迫下基因表达谱，分离识别耐盐相关基因。【方法】分别对红树植物-秋茄进行海水和淡水处理。分时提取总RNA进行等量混合，获得两种不同处理的样品池。采用cDNA-AFLP技术进行表达差异分析。【结果】256对引物组合共筛选了约15 000个cDNA片段，获得差异片段61个。差异基因表达模式分为2类，即海水处理诱导上升和下调表达，其中上升表达的基因片段为36个，下调表达的基因片段为25个;其中38个可视为已知基因。按照其功能分类可分为8大类：基础代谢、跨膜蛋白、信号转导、蛋白质代谢、转录因子、细胞骨架、抗病蛋白、假想蛋白，而其中又以基础代谢相关基因所占比重最大。【结论】构建了红树植物-秋茄在盐胁迫下的基因表达谱，从基因组水平上识别了一批受盐胁迫诱导或抑制表达、与耐盐相关的基因，这些新基因可用于耐盐的分子机理研究。     

菜心抗虫性的cDNA-AFLP分析

【目的】探讨菜心抗虫性的分子机制,为抗虫品种选育和抗虫基因挖掘提供理论支持和中间材料。【方法】选用抗小菜蛾品种65和感小菜蛾品种69菜心为亲本构建F2作图群体,利用cDNA-AFLP标记构建转录图谱、分析差异基因表达,筛选和克隆抗虫相关转录衍生片段。【结果】14对引物组合共扩增出330条扩增带,其中238条为多态性带,多态性条带比例为56.00%~100.00%,平均为73.86%,平均每对引物扩增24条带,多态性条带17个。构建的cDNA-AFLP转录图谱由5个连锁群组成,193个标记未能定位在连锁群上,42个位点定位在5个连锁群上,总长度为575.869 c M,平均图距为115.1738 c M。每个连锁群上的标记数为2~23个,平均为8个。5个连锁群的LOD值变化范围为9.923~12.71,平均为13.207。A1连锁群上的分子标记分布不均匀,出现成簇分布现象和出现了5个较大的断裂。共有18个偏分离位点,偏分离比例为42.86%。在330个位点中,异常分离位点103个,占总位点数的34.24%。对克隆测序成功的10个转录衍生片段分析表明,1个TDF5-1-1与防御相关基因GW775571.1具有高度的序列同源性,8个TDF与大白菜花蕾败育相关基因GR308173.1高度同源,1个与功能未知基因EX106546.1高度的序列同源。【结论】cDNA-AFLP标记能可初步从转录组水平上揭示抗虫菜心群体的连锁遗传规律及抗虫分子机制,其抗性相关基因可进一步用于小菜蛾抗性育种。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的cDNA-AFLP分析

 【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。     

番鸭就巢性状相关基因表达的cDNA-AFLP分析

【目的】寻找与番鸭就巢性状相关的表达基因,了解其就巢调控的分子机理。【方法】采用cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length polymorphism)技术分析遗传背景相近的RF系白羽番鸭就巢个体和非就巢个体脑垂体基因表达差异。【结果】筛选到与就巢行为相关差异表达片段82条,选取其中15条进行测序。将测序结果在GenBank数据库进行BLAST比较和分析,发现 8个片段(53.3%)与已知基因具有较高同源性,涉及与繁殖性能紧密相关的下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)上的功能基因,如GnRH基因、FSH基因,同时也分离到位于GH／IGF轴上的功能基因,即GH基因;以及在功能上属于信号传导、转录调控、代谢的调节基因,如超氧化物歧化酶基因、角蛋白关联蛋白基因、硫氰酸酶释放硫基转移酶基因等。2个片段与未知功能的基因有同源性,5个与数据库中现有的基因没有明显的相似性。随机选择3个片段进行RT-PCR验证,检测片段的表达模式与cDNA-AFLP结果一致。【结论】揭示番鸭不同就巢性状基因表达调控模式,进一步阐明番鸭就巢的分子机理。     

干旱胁迫棉花转录组DNA损伤修复相关基因的分析

【目的】研究干旱胁迫下,棉花DNA损伤修复基因的表达情况,从整体水平探讨棉花DNA损伤修复相关基因表达与抗旱的相关性。【方法】用2.5%PEG6000处理棉花幼苗,利用RNA-Seq技术对干旱胁迫下棉花幼苗的转录组进行测序。【结果】从棉花干旱胁迫响应的转录组中,筛选获得差异表达的DNA损伤修复相关基因共51个,其中差异表达的上调基因23个,差异表达的下调基因28个,干旱胁迫能够影响棉花DNA损伤修复相关基因的表达。选取4个差异基因进行生物信息学分析及qRT-PCR验证,HMGB1、rec A1、UDGs和GMP synthase基因的表达变幅有一定的差异,但基因的表达趋势一致,棉花转录组测序结果通过qRTPCR验证是可靠的。【结论】DNA损伤修复相关基因可能与干旱胁迫有一定的相关性,干旱胁迫能够影响棉花DNA损伤修复相关基因的表达。     

乙烯利调控甘蔗基因差异表达研究

【目的】建立并优化乙烯利调控甘蔗基因差异表达的cDNA-AFLP分析体系和银染体系,利用该技术对乙烯利处理的甘蔗进行基因差异表达研究,探讨乙烯利调控甘蔗生长的分子机理。【方法】以甘蔗品种ROC16为材料,在甘蔗生长40 d左右时,叶面喷施200 mg/L乙烯利溶液(对照为清水)0、3、6、12、24、48 h后,分别取甘蔗叶片提取总RNA,建立cDNA-AFLP分析体系和银染体系;利用193对引物组合对乙烯利处理和对照的甘蔗叶片RNA混合池的样品进行差异表达分析,对部分差异转录片段进行回收、克隆、反向Northern杂交验证、序列分析和功能分析等。【结果】经cDNA-AFLP体系反应扩增,乙烯利处理和对照每个样品的扩增条带数均在35～80之间,处理和对照之间条带多态性明显。在反向Northern杂交验证分析中,24个测试样品中有11个无差异,假阳性率高达46%;在乙烯利作用下,甘蔗的CHI、GST、ARP、LHC、核结合蛋白基因以及一批未知基因差异表达,其中CHI、GST、LHC和核结合蛋白基因是与促进植物的抗病抗逆、提高光合作用等密切相关的因子。【结论】cDNA-AFLP技术是研究乙烯利诱导甘蔗相关基因差异表达和调控的一种较有效方法,具有可行性。乙烯利可能是通过调控甘蔗体内GST、CHI、ARP和LHC等基因的表达,从而表现出促进甘蔗生长、提高光合作用、增强抗病抗逆性等生理效应。     

白菜转录因子BcBHLHogu的克隆及其特征分析

 【目的】探明白菜‘矮脚黄’OguCMS核质互作的机制。【方法】采用cDNA-AFLP技术分析白菜‘矮脚黄’OguCMS及其保持系花蕾基因的表达差异，获得一个在保持系早期花蕾不表达但在OguCMS早、中、晚花蕾中稳定表达的差异片段。利用RACE技术获得其cDNA全长，命名为BcBHLHogu（GenBank 登录号：EF127860）。【结果】该基因编码122个氨基酸，具有basic helix-loop- helix（bHLH）结构域；进化分析表明，BcBHLHogu与拟南芥AtBHLH060同源性最高，是冗余基因AtBHLHs060/048的直系同源基因，其功能与BEEs1/2/3（3个油菜素内酯信号的早期应答冗余基因）相似。【结论】BcBHLHogu是白菜bHLH转录因子家族的一个新成员，涉及到花器官发育信号事件，其功能与油菜素内酯应答有关。     

光周期诱导菊花成花及成花逆转过程中生理代谢的变化

本试验以切花菊品种神马为试材，研究了不同光周期处理过程中菊花叶片可溶性总糖、蔗糖、可溶性蛋白、RNA和DNA等含量的变化。结果表明，长日照处理的菊花未形成花芽，始终保持营养生长，其叶片可溶性总糖、蔗糖、可溶性蛋白、RNA和DNA含量没有明显变化，一直保持较稳定水平。短日照处理的菊花叶片可溶性总糖和蔗糖比长日照处理减少，可溶性蛋白质、RNA和DNA含量都比长日照处理增加。先短日照后长日照处理的菊花在短日照期间形成的花芽在转入长日照时花芽停止发育和膨大，最终未开花，其叶片可溶性总糖含量比长日照处理减少，处理第15d以后比短日照处理增加，而蔗糖、可溶性蛋白、DNA和RNA含量比其它处理明显增加。     

甘、芥种间杂交后代DH株系K0959 PEG干旱

【目的】了解甘、芥种间杂交后代抗旱材料K0959在干旱胁迫处理下相关基因的表达情况。【方法】利用cDNA-AFLP技术,以经25% PEG-6000胁迫处理的K0959植株叶片为材料,比较其与非胁迫处理对照的基因表达差异。【结果】从128个引物组合中筛选出16个引物组合,可获得30余条差异片段;经二次扩增,可获得15个大小为102～384 bp、在胁迫中表达的差异片段。通过对片段的克隆测序、同源性比对,15个差异片段中,有7个片段与拟南芥的mRNA同源性较高,其中4个片段（2B, 2D, 3-2B和14B）为非重复的TDFs;1个片段（3D）与甘蓝的同源性较高,1个片段（2C）与甘蓝型油菜的mRNA同源性较高,而6个大小为102～240 bp的片段（D2-1、6A和9-2C等）在GenBank中与已知基因或序列无任何同源性,可能为尚未发现的新基因。其中6个已知功能的TDFs片段分别参与能量、新陈代谢、细胞运输途径以及细胞周期和DNA加工等过程。【结论】获得的差异表达基因对于了解甘、芥种间杂交后代油菜抗旱性形成的调控机制具有参考价值。     

大白菜果胶甲酯酶基因BrPME1的克隆及特征分析

 【目的】克隆大白菜果胶甲酯酶基因,为进一步探讨果胶代谢在大白菜育性调控中的分子机制提供帮助。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-24,通过RACE技术扩增该基因的cDNA全长序列,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,利用荧光定量PCR技术分析基因时空表达模式。【结果】该基因编码大白菜果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11),被命名为BrPME1(GenBank登录号：HM185497)。BrPME1全长cDNA序列为1 290 bp,编码1个包含363个氨基酸的前体蛋白。BrPME1蛋白N末端1—23位为信号肽,成熟蛋白含有保守的果胶甲酯酶酶活结构域,而不含酶活抑制位点。预测BrPME1蛋白含有10个磷酸化位点、1个酰胺化位点和6个N端豆蔻酰基化位点。BrPME1在两用系不育株花蕾中表达量很低,在可育株的大花蕾以及成熟花药中高水平表达。【结论】BrPME1是一个受大白菜细胞核雄性不育基因抑制的果胶甲酯酶基因家族成员。     

蕙兰Flowering locus T基因的克隆及其对开花的影响

【目的】 探讨CfFT基因在蕙兰成花中的作用。【方法】采用RT-PCR结合RACE技术从蕙兰(Cymbidium faberi)中克隆Flowering locus T（FT）同源基因CfFT。采用实时定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期CfFT进行表达分析。将该基因克隆到PBI121载体上导入烟草中,并对不同转基因烟草株系中的CfFT、NFL、NtFUL和NAP1基因进行实时定量RT-PCR分析。【结果】对蕙兰花芽分化不同时期的CfFT的表达分析表明,CfFT在花芽分化初期的表达量最高,之后随着花芽的成熟表达量逐渐降低。将CfFT导入烟草进行异源表达,转基因株系表现出明显的早花表型。对开花时间不一的转基因株系中的CfFT表达分析表明,其表达量与转基因烟草开花时间早晚成正比。进一步对这些株系内源的NFL、NAP1和NtFUL表达分析表明,NFL、NAP1和NtFUL基因的表达量与CfFT表达成正比,说明NFL、NAP1和NtFUL的表达受FT基因的上游调控。【结论】在烟草中异源表达蕙兰中的CfFT基因能促进烟草提前开花。