越橘EST-SSR分子标记的开发及其遗传多样性分析

【目的】探讨越橘EST序列中SSR位点的分布规律,开发越橘EST-SSR引物,并分析其在越橘品种遗传多样性研究中的作用。【方法】以91份越橘种质为材料,利用越橘果实转录组(RNA-Seq)的测序结果,通过SSRIT在线搜索,利用Primer Premier 5.0软件设计30对引物,并筛选扩增效果理想的引物,用筛选出的引物分析91份种质的多态性,构建91份种质的系统发育树。【结果】34 464条越橘unigene序列中含有SSR位点的序列有829条,SSR位点有913个,其中二核苷酸、三核苷酸重复是主要的SSR类型,分别占全部SSR位点的13.69%和81.27%。不同核苷酸数目重复基元的重复次数差异很大;越橘EST-SSR位点集中在11~15bp;三核苷酸和六核苷酸重基元复种类最多,在所有重复基元中GAA/TTC发生频率最高。设计的30对引物中有17对引物在供试越橘种质中扩增出理想的PCR产物,17对引物均有多态性。聚类分析结果显示,在遗传相似系数为0.69时,可以将供试越橘种质分成4组。【结论】EST-SSR标记可以用于越橘品种的鉴定与遗传多样性分析。     

紫苏EST-SSR分布特征及标记开发

为了解紫苏属植物的遗传多样性,为种质资源的开发利用提供依据,利用软件MISA对从NCBI上获取的5 435条EST序列进行紫苏SSR分析。结果表明:在1 206条EST序列中得到符合条件的SSR为22.19%;共检出1 526个SSR位点,平均覆盖深度为28.87%;EST-SSR有32种重复基元,以二核苷酸重复基元AG/CT最多,占检出总SSR的34.73%;包含低级基元单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复,其长度在20bp以上的EST-SSR有386条。最终设计获得包含单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复低级基元的SSR引物723条。     

西洋参EST资源的SSR信息分析

为了进一步利用现有的西洋参EST-SSR资源,从NCBI公共数据库中下载了4988条西洋参EST,全长为2616.042 kb.含SSR的E ST序列313条,共349个SSR,平均每相隔7.5 kb出现1个SSR.SSR出现的频率和平均长度分别为7.00%和24.4 bp.在1～6 bp的重复基元中,三核苷酸重复基元出现频率最高,为34.09%;其次为二核苷酸重复基元和单核苷酸重复基元,分别为32.09%和21.78%.出现最多的重复基元为A/T(20.9%),其次是AT/TA(16.9%).结果显示,西洋参的EST数据库中SSR序列出现频率较高,类型较丰富、多态性较高,根据西洋参EST建立其EST-SSR标记是一条简便而又有效的途径.     

利用芥菜转录组信息挖掘SSR标记及用于种质分析

【目的】为开发高效的芥菜Brassicajuncea.分子标记。【方法】本研究通过对芥菜转录组测序的信息搜索SSR位点并分析其分布特点,应用Primer 3.0软件设计SSR引物,随机选择50对引物扩增44份芥菜种质,检测其多态性。【结果】芥菜转录组测序共获得55 636条unigene,全部序列有48 193 376 bp;有7 834条unigene包含SSR的序列,从中鉴定出9 526个SSR位点,其中有1 371条序列包含1个以上SSR,复合SSR有572个,SSR发生频率为14.08%。优势重复基序为三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR的51.12%和41.91%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点的34.74%,三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主,占总位点的18.30%。共设计出21 282对SSR引物,随机选择50对引物进行PCR扩增,其中41对扩增出清晰可重复的预期条带,17对(占34%)在44份芥菜种质中表现出多态性。应用UPGMA得到将44份供试材料分为4大类聚类图,可准确地体现了芥菜种质材料的关系。【结论】根据芥菜转录组数据能开发出类型丰富、效率较高的SSR标记,为芥菜亲缘关系分析和遗传图谱构建等提供更可靠的标记。     

栲属EST序列中微卫星含量及特征

采用生物信息学方法对栲属Castanopsis(D.Don)Spach EST序列中微卫星DNA的含量、分布、碱基组成和频率等进行了分析。通过搜索,在3354条栲属EST序列中共查找到802个SSR位点,平均1.733 kb核苷酸序列分布一个SSR位点,其中有74.56%的SSR位点分布于长度为500~799 bp的EST序列。栲属EST-SSR的主要重复类型为二核苷酸,占SSR总数的42.39%。此外,A/T(97%)、AG/CT(80%)、AAG/CTT(30%)分别为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元。现有栲属EST-SSR的长度分布于10-224 bp之间,重复数总平均为9.11次,其中有29.30%的EST-SSR长度大于20 bp。研究结果表明,栲属EST-SSR具有丰富的多态性,可利用栲属EST-SSR序列开发一批具有应用价值的SSR分子标记供遗传多样性研究所用。     

柴胡转录组SSR的分布及序列特征分析

【目的】分析柴胡转录组中SSR的分布及序列特征,为开发多态性良好的、功能基因相关的SSR标记提供理论依据。【方法】以不同温度处理的柴胡种子为材料,经高通量转录组测序后,使用Trinity对测序结果进行de novo组装,并利用MISA对组装得到的Unigenes进行SSR位点搜索,最后统计分析SSR的分布及序列特征。【结果】从转录组数据组装获得244194条Unigenes,其N50值为1036 bp,平均长度791 bp,总长度193138105 bp。从Unigenes序列中共检测到50303个SSR位点,去除20405个复合型SSR位点,以29898个单一型SSR位点为后续分析对象。转录组SSR的出现频率为12.24%,平均分布距离6.46 kb,主要重复基元类型为二核苷酸,共17105个,占SSR总数的57.21%,其次为三核苷酸和单核苷酸,分别占SSR总数的20.75%和20.46%,四核苷酸~六核苷酸重复基元数量均较少。转录组SSR中,共有97种重复基元,其中二核苷酸和三核苷酸重复基元分别以AT/AT和ATC/GAT为主,分别占SSR总数的33.33%和3.98%;重复次数5~10次的SSR位点数量最多,共27942个,占SSR总数的93.46%。转录组SSR序列长度存在明显差异（12~76 bp）,平均长度15.28 bp。【结论】柴胡转录组的SSR位点出现频率较高,类型较丰富,具有开发出高多态性SSR分子标记的潜力,将其用于柴胡的遗传多样性分析、种质资源评价及分子标记辅助育种等研究。     

草莓EST-SSR标记开发及在品种遗传多样性分析中的应用

 【目的】探讨草莓EST序列中SSR位点的分布规律,开发草莓EST-SSR引物,并分析其在草莓品种遗传多样性研究中的应用。【方法】从NCBI公共数据库下载草莓表达序列标签（expressed sequence tag,EST）55 750条,利用MISA软件查找SSR位点,并利用Primer3.0 Plus软件设计60对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物进行克隆和测序,以验证其真实性。【结果】55 750条草莓EST序列含有SSR位点的序列1 334条,SSR位点1 490个。其中,二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占36.17%、26.51%和19.87%。60对引物中有42对引物能在20个草莓品种中扩增出理想的PCR产物,其中36对引物扩增条带具有多态性。利用11对验证的EST-SSR引物分析了20个草莓品种的亲缘关系。【结论】草莓EST-SSR标记的开发对于草莓品种鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

苦荞转录组EST-SSR发掘及多态性分析

利用Misa软件对苦荞种子转录组高通量测序获得的45 699条EST序列进行了SSR位点扫描,共得到2 700个SSR位点,分布于2 624条EST序列中,SSR位点平均距离为1/1.73 kb。随着EST序列长度的增加,含SSR位点序列的比例也随之升高,800 bp以上EST序列含SSR的比例明显高于800 bp以下序列。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复是苦荞EST-SSR主导类型,分别占总SSR的52.11%、13.33%和30.63%,其中(A)n、(AG)n和(AAG)n是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基序,分别占总SSR的51.85%、7.11%和8.93%。设计合成了150对 EST-SSR 引物,其中91对引物（60.67%）在40份苦荞种质中获得有效扩增,30对引物（32.97%）具有多态性。平均每对引物能检测到3.53个等位变异;多态信息含量（PIC）在 0.10~0.71之间,平均达0.40。以上结果说明,从苦荞转录组EST序列中大规模开发SSR标记是一条简便而可行的途径。     

梨EST-SSR标记的开发及其在梨品种遗传多样性分析中的应用评价

 【目的】分析梨EST中SSR位点分布规律,开发梨EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于梨品种遗传差异研究的可行性。【方法】从NCBI公共数据库中下载梨表达序列标签(expressed sequence tag,EST)1 293条,利用MISA软件对其进行SSR位点查找,将符合条件的序列选出,利用Primer3.0 Plus软件设计48对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物克隆与测序,以验证其真实性。【结果】1 293条梨的EST序列中含有SSR位点的序列为82条,SSR位点92个。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占48.91%、17.39%和17.39%。48对引物中有31对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中27对引物扩增条带具有多态性。同时发现11对引物中,有83.87%的片段具有相应的SSR位点。聚类结果表明,梨被明显地区分成东方梨和西方梨两大群,分类效果明显。【结论】梨EST-SSR标记开发效率较高,是梨SSR标记开发的重要措施,对于梨品种的鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

桑树EST—SSR引物开发

【目的】利用桑科的EST数据库进行桑树EST—SSR引物开发,为丰富桑树SSR数据库提供参考。【方法】下载NCBI中桑科的EST数据库,进行序列处理及拼接后,用SSRIT搜索其中的SSR位点,以Primer Premier 5．0设计引物,选用5个桑树品种各5株样品进行多态性引物筛选。【结果】下载的EST拼接后得到2008条拼接片段（contig）,共搜索到831个SSR位点,分布在799个contig中。二、三核苷酸重复基元是主导类型,分别占总SSR的66．06％和32．37％;TC／AG和CT／GA是二核苷酸优势重复基元,分别占二核苷酸总数的28．64％和25．87％。设计合成77对EST—SSR引物,其中46对能够扩增出有效条带;经多态性筛选,26对引物可扩增出多态性条带。【结论】利用桑属近缘属的EST序列进行桑树EST—SSR引物的开发是可行的;开发出的26对多态性引物可用于桑树遗传多样性分析和种质鉴定等。     

尖镰孢EST-SSR信息分析及分子标记建立

【目的】探讨尖镰孢（Fusarium oxysporum）表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列中简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点的分布特点,开发尖镰孢EST-SSR引物,为镰孢菌遗传多样性分析提供技术支持。【方法】从NCBI公共数据库下载尖镰孢EST 9 304条,利用SSRIT软件查找SSR位点,Primer Premier 5.0软件设计EST-SSR引物,用非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分离SSR-PCR扩增产物,并选用能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的引物,对23株尖镰孢菌株进行SSR遗传多样性分析。【结果】在尖镰孢EST序列中,共搜索到92个SSR位点,分布于90条EST序列中,出现频率为1.0%。其中二核苷酸重复类型是最主要的SSR类型,占总SSR的比例为59.78%。其次为三核苷酸与五核苷酸重复类型,占总SSR的比例分别为17.39%、11.96%。出现频率最高的基序是（AC/GT）（0.51%）。设计合成的30对引物中有20对（66.7%）能够有效扩增,其中14对引物（46.7%）能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的产物。尖镰孢的遗传多样性分析结果表明,利用筛选出的14对引物扩增出62条条带,其中多态性条带59条,多态性位点比例为95.2%,平均每对引物可扩增4.2条。供试菌株间的遗传相似系数为0.487-0.933,平均为0.686。供试菌株间存在明显的遗传分化。聚类分析结果表明,当遗传相似系数为0.781时,除14号菌株外,所有菌株均根据寄主来源划分为不同的SSR类群。【结论】基于尖镰孢EST序列开发SSR标记是一种简便有效的方法,研究开发的14对引物可用于尖镰孢的遗传多样性分析。     

四倍体野生种花生A.monticola全基因组SSR的开发与特征分析

【目的】通过对四倍体野生种花生Arachis monticola（AABB,2n = 4x = 40）全基因组SSR位点搜索,研究其全基因组SSR分布特征及规律,开发并验证其全基因组SSR引物,为花生属植物遗传进化分析及重要性状分子标记开发提供依据。【方法】在华大基因GigaScience数据库下载A.monticola全基因组序列,并利用生物信息学软件MISA进行SSR位点搜索,Primer 3进行引物设计,通过电子PCR进行单位点SSR分析,并随机合成100对SSR引物验证通用性。【结果】SSR在四倍体野生种花生A.monticola基因组上共搜索到SSR位点676 878个,平均每3.8 kb就会出现一个SSR,分布于5 127条scaffold中,单核苷酸至六核苷酸均有分布,且数量上差异较大,以单碱基、二碱基、三碱基为主,三者占SSR总数的94.28%,其中单碱基重复数量最多,占46.71％,密度最高;六核苷酸重复数目最少,分布最稀疏。大多数SSR分布在基因间区,基因区SSR多分布于内含子区域;全基因组共鉴定出395个不同的重复基元,其中A亚基因组342种,B亚基因组356种;A/T是最丰富的重复基元;在1—6个核苷酸的重复基元中,数量最多的依次是A/T、AT/AT、AAT/ATT,AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT、AAAAAT/ATTTTT;整体来看,重复基元的重复次数多集中在50次以内,不同类型的motif的重复次数差异很大;同一种类型重复基元的SSR位点,随着motif重复次数增加,SSR的数量逐渐降低;B03染色体上SSR数量最多,A08染色体中SSR密度最高。A.monticola全基因组SSR比A.duranensis、A.ipaensis基因组SSR数量多,密度也更高,A.monticola单核苷酸重复最丰富,2个野生种二核苷酸数量最多。共设计出SSR引物192 303对,单位点SSR标记检出率50.35%,单点SSR标记在基因组上的分布呈现两端密集,中间稀疏的特点;随机合成的100对引物中,90对能在A. monticola中扩增出稳定清晰的条带,且在4份不同的花生基因组DNA中扩增目的条带表现出不同的特点。【结论】A.monticola基因组内SSR种类和数量丰富,单核苷酸至六核苷酸均有分布,单核苷酸重复基元数量最多,且最密,六核苷酸重复基元数量最少,出现频率最低,不同重复基元频数高低与核苷酸数量没有严格相关性,SSR多分布在基因间区,基因区内含子区域SSR数量最多;A.monticola A、B亚基因组具有其各自特异的重复基元类型;单个类型重复基元数量最多的均为AT富集的重复基元,而GC富集的重复基元相对较少;同一种类型重复基元的SSR位点,随着motif重复次数增加,SSR的数量逐渐降低;A.monticola全基因组SSR较2个二倍体野生种数量更多,密度也更高且重复基元分布规律不同;经过初步验证,开发的SSR引物在4份花生材料中表现出部分通用性。     

辣椒疫霉EST-SSRs标记的发掘

通过对GenBank上发布的55 848条辣椒疫霉EST的鉴定,在328条EST中发现331个SSR.在筛选的EST序列中SSR平均密度为每23.7 kb含有1个SSR.在鉴定的SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占鉴定总数的59.5%;其次为二核苷酸乖复基元的SSR类型,为39.3%;四核苷酸重复基元的SSR类型最少,为1.2%.设计40对SSR引物对5个辣椒疫霉菌株基因组DNA进行PCR扩增,有27对引物扩增出SSR特征条带,其中有18对引物在5个辣椒疫霉菌株间扩增出多态性条带25条.基于SSR标记进行聚类分析,可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为3类.该研究是辣椒疫霉的SSR标记开发的首次报道,为辣椒疫霉的遗传变异和分子作图等分析提供了一种有效的分子标记系统.     

大花序桉基因组SSR的分布特征及序列分析

【目的】分析大花序桉基因组SSR的分布特征及序列分析,为大规模开发大花序桉分子标记辅助育种的SSR标记提供理论依据。【方法】通过高通量测序获得大花序桉基因组序列信息,经严格过滤、拼接和组装后获得scaffolds,利用MISA网站对Scaffolds进行SSR位点检索及分析,并利用Primer 5.0对具有较大多态性开发潜力（二基元重复次数≥10、三基元重复次数≥7）的SSR标记进行引物设计,随机挑选48对基因组SSR引物进行有效性检测及有效扩增引物筛选。【结果】大花序桉基因组共含有177750个SSR位点,包括171530个SSR独立位点和6220个复合型SSR位点;SSR发生频率为17.86%,分布密度为1/3.13 kb。大花序桉基因组SSR基元类型较丰富,以单核苷酸重复基元类型数量最多,占基因组总SSR数量的69.33%,其次为二、三核苷酸重复基元类型,分别占基因组SSR数量的21.01%和7.58%,四、五、六核苷酸的重复基元类型所占比例均相对较低,三者的比例含量总和为2.08%。SSR基元类型以AG/CT占绝对优势（16812个）,其次为AT/AT（8193个）和AAG/CTT（4404个）。从48对SSR标记引物中筛选出31对引物能有效扩增出清晰、明亮条带且大小与预期相符,其中有14对在6个大花序桉样本中均呈现多态性,多态百分率为29.17%。【结论】大花序桉基因组SSR位点发生频率高,基元类型较丰富,SSR多态性标记开发潜力大。该研究结果为进一步大花序桉SSR引物开发和筛选,以及开展大花序桉及其他桉树遗传多样性分析和遗传图谱构建提供依据。     

苹果EST-SSRs标记开发及其应用于苹果品种遗传多样性分析

该研究旨在分析苹果EST中SSR位点分布规律,开发苹果EST-SSR引物,探究基于EST-SSR的苹果品种遗传差异。从NCBI公共数据库中下载63 708条苹果表达序列标签(Expressed sequence tag,EST),首先利用MI-SA软件进行SSR位点查找,筛选出符合条件的SSR位点,利用Primer 5.0 Plus软件设计49对引物,用非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)研究这些SSR引物的PCR扩增产物,总结其特点,并回收部分产物测序,以验证其真实性。结果显示63 708条苹果的EST序列中有5 423条含有总计6 153个SSR位点。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占总SSR的50.38%、14.85%和15.47%。电泳结果显示有33对引物能在22个苹果品种中扩增出理想的PCR产物,其中25对引物能扩增出多态性条带,测序结果显示引物能扩增出目标片段。ES7-SSR分子标记体系的聚类结果与富士系苹果家族关系基本吻合。     

丁香假单胞菌基因组内简单重复序列的比较分析

【目的】分析丁香假单胞菌3个致病变种基因组内简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),为病菌SSR标记开发和遗传多样性研究提供有用信息。【方法】基于公共的基因组数据库资源,对3个菌株的完全重复SSR和不完全重复SSR的丰度和组成类型等进行分析。【结果】3个菌株完全重复SSR的分布规律较为相似,其中单碱基的短重复SSR均占绝对优势,多碱基和长重复SSR则较少;菌株B728a、1448A和DC3000的不完全重复SSR总数也较相近,分别为562、529和567,其中数量最多的均为六碱基重复。但3个菌株以四、五和六碱基为基序的SSR在基序组成和数量上则表现出较高的变异性,完全重复SSR中,除AGCC、ACCTGC等基序在两个菌株中同时出现,绝大多数基序仅在单个菌株基因组内出现;不完全重复SSR中,部分基序如CCCTG、ACGCA等的出现频率在不同菌株间存在明显差异。【结论】3个菌株的不完全重复SSR在数量和结构类型上均具有较大的相似性,而菌株间的完全重复SSR在数量和组成上则存在一定差异。     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST—SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Jug—lans regia Linn．）ESTs序列进行EST—SSR特征分析,利用Primer3．0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3．97％,平均分布距离为21．12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31．40％和35．27％;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST．SSR引物,将为胡桃科EST—SSR分子标记的开发奠定基础。     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST-SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Juglans regia Linn.）ESTs序列进行EST-SSR特征分析,利用利用Primer3.0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3.97%,平均分布距离为21.12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31.40%和35.27%;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST-SSR引物,将为胡桃科EST-SSR分子标记的开发奠定基础。