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相似文献
 共查询到16条相似文献,搜索用时 165 毫秒
1.
【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时,以0.3 mmol•L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg•L-1。Western blotting 检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到 1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。  相似文献   

2.
【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV9病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,  相似文献   

3.
旨在分析并预测细粒棘球绦虫锌指蛋白(Echinococcus granulosus zinc finger peotein,Eg-ZFP)结构、功能及其在细粒棘球绦虫发育过程中的表达模式,预测其在细粒棘球绦虫防治中潜在的作用。通过对前期细粒棘球绦虫原头蚴(protoscolex,PSC)转录组高通量测序结果中Unigene进行筛选,克隆Eg-ZFP基因并进行序列分析,实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)分析Eg-ZFP在原头蚴及成虫中的表达特征,利用全量组织原位杂交(Whole mount in situ hybridization,WISH)检测该蛋白mRNA在原头蚴和成虫组织中的分布情况。结果显示,细粒棘球绦虫Eg-ZFP基因的CDS序列长852bp,具有完整的开放阅读框(852bp),编码283个氨基酸,预测表明Eg-ZFP分子质量大小及等电点为31.6ku和8.89;qPCR检测发现,Eg-ZFP在原头蚴及成虫阶段均有表达,且在成虫阶段表达量高;全量组织原位杂交检测结果表明,Eg-ZFP mRNA在原头蚴及成虫中分布广泛,且在成虫的生殖系统中丰度较高,提示Eg-ZFP与虫体生殖发育有关。结果表明Eg-ZFP在细粒棘球绦虫发育过程中具有重要作用,为进一步研究Eg-ZFP在E.granulosus防治中的作用奠定基础。  相似文献   

4.
在ELISA法作用之下应用高纯度细粒棘球绦虫六钩蚴抗原、以及囊液抗原,分别针对一次感染、以及二次感染细粒棘球绦虫六钩蚴小鼠血清进行测定,用ELISA法对所测定结果详细分析。对模型小鼠原发性感染细粒棘球绦虫后,特异性抗体的变化规律展开分析与研究。  相似文献   

5.
 【目的】探讨细粒棘球蚴CE18重组蛋白作为绦虫蚴病免疫诊断抗原的应用价值,为筛选绦虫蚴病血清学诊断抗原提供依据。【方法】应用棘球蚴CE18重组抗原建立间接ELISA方法,分别对18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、19份棘球蚴感染绵羊血清及194份棘球蚴病疫区绵羊血清和13份健康羊血清进行检测,通过显著性差异分析评价CE18蛋白作为诊断抗原的意义。同时,应用生物学软件对CE18抗原蛋白同源序列进行分析,进一步从分子水平上提示CE18蛋白作为绦虫蚴病诊断抗原的依据。【结果】序列分析表明棘球蚴CE18蛋白基因为多种绦虫如泡状带绦虫、多头带绦虫、猪带绦虫等的共有序列,其蛋白质氨基酸序列相似性很高,不同种属之间高达99%,从分子水平上表明CE18蛋白为带绦虫蚴共同抗原成分之一。重组抗原CE18-ELISA方法检测绵羊血清抗体水平显示:脑多头蚴病、细颈囊尾蚴病、棘球蚴病和棘球蚴病疫区血清的阳性率分别为38.89%、73.33%、100%和76.14%,而对照组血清为阴性反应。【结论】CE18重组蛋白可作为绵羊棘球蚴病和细颈囊尾蚴病血清学诊断抗原,用于畜群活体检疫初筛试验。  相似文献   

6.
【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。  相似文献   

7.
【目的】制备培氟沙星(Pefloxacin,PEF)完全抗原,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】以培氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)为材料,用碳二亚胺(EDC)法制备培氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原(PEF-BSA),变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及紫外扫描(UV)检测其免疫学特性;利用PEF-BSA免疫BALB/c小鼠,无菌条件下收集血清,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价。并用同样的方法制备和鉴定培氟沙星-鸡卵清白蛋白完全抗原(PEF-OVA)。【结果】培氟沙星与牛血清白蛋白及鸡卵清白蛋白偶联成功,PEF-BSA偶联比为8∶1,PEF-OVA偶联比为6∶1。间接ELISA测得多抗血清效价均达到4 000以上,得到了较好的免疫效果。【结论】成功得到了培氟沙星完全抗原,该抗原具有较强的特异性及良好的敏感性。  相似文献   

8.
【目的】本文构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)HSP20基因的重组表达载体并表达、纯化重组蛋白,研究其反应原性。【方法】根据Gen Bank中Eg HSP20蛋白基因c DNA序列设计特异性引物,以细粒棘球蚴Eg头节总RNA为模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆至p MD19-T载体,测序验证后,将Eg HSP20抗原基因亚克隆至表达载体p ET-32a中,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化及反应原性分析。【结果】Eg HSP20 c DNA全长945个核苷酸,编码314个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,5个PKC磷酸化位点,10个CKⅡ磷酸化位点;抗原表位区集中在39~53位和120~168位。SDS-PAGE检测显示,重组菌可表达分子量为51 k Da的重组蛋白;Western blot结果显示,表达的重组蛋白Eg HSP20抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应。【结论】证实Eg HSP20蛋白具有较强的反应原性,为进一步利用Eg HSP20重组蛋白作为Eg感染诊断中候选标识分子奠定了前期基础。  相似文献   

9.
【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物(CTN-OH);采用N, N-羰基二咪唑法(CDI)将CTN-OH与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。  相似文献   

10.
【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光(IFA)快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达103。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物(MDEF)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒(PMV)和鸭肝炎病毒(DHV)均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法(VI)的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。  相似文献   

11.
【目的】探索EgM家族重组蛋白(EgM9)与Iscom为佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律。【方法】利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgGI、gG1I、gG2、IgA、IgM和IgE)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证。【结果】经统计学方法分析显示,免疫组与对照组特异性抗体IgG及其亚类IgG1I、gG2,差异极显著(P<0.01),而特异性抗体IgAI、gM和IgE差异不显著(P>0.05)。【结论】证实EgM家族重组蛋白(EgM9)与Iscom为佐剂结合能引起犬特异性免疫应答。  相似文献   

12.
 【目的】制备麦长管蚜单克隆抗体,为进一步研究麦蚜的捕食性天敌种类奠定基础。【方法】应用杂交瘤技术制备单克隆抗体;双抗夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA)鉴定抗体类型及亚类;间接ELISA测定抗体特异性;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot印迹分析确定抗体结合蛋白。【结果】制备出2株高度特异性的麦长管蚜单克隆抗体,分别命名为EGA-1E8和EGA-4H11,分别属于IgM亚类和IgG2b亚类。麦长管蚜抗原由多种多肽组成,其中单克隆抗体EGA-4H11与麦长管蚜抗原54.2 kD的多肽结合。特异性试验表明,这2种抗体不与麦田中其他种类的昆虫和蜘蛛发生交叉反应。【结论】成功地制备了麦长管蚜单克隆抗体,为进一步研究麦蚜的捕食性天敌种类奠定了可靠的基础。  相似文献   

13.
新疆双峰驼抗血清中重链抗体的分离鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】初步探讨新疆双峰驼Camelus bactrianus免疫系统中缺失轻链的重链抗体(heavy chain antibody,HCAb)是否具有常规抗体的基本抗原结合功能。【方法】采用本实验室构建的丹毒丝菌表面蛋白A原核表达载体pGEX4T-1-spaA-N,进行诱导表达,纯化获得重组抗原GST-SpaA-N,免疫双峰驼制备抗血清,经Protein A和Protein G亲和层析从抗血清中分离重链抗体及常规抗体,Western blotting鉴定重链抗体的抗原结合特性,间接ELISA比较重链抗体与传统抗体的抗原结合活性。【结果】经过Protein A/G纯化得到了IgG2。对各组分进行分析初步表明重链抗体约占血清IgG的60%—80%。采用GST-SpaA-N免疫双峰驼可以诱导高滴度的IgG2型重链抗体,在5次免疫后,骆驼抗spaA-N特异的重链抗体IgG2多抗血清的效价为1﹕51200。Western blotting结果显示分离的多克隆重链抗体可特异结合SpaA天然抗原,且ELISA分析结果表明重链抗体与常规抗体具有相同的抗原结合活性。【结论】首次从双峰驼抗血清中成功分离获得具有与常规抗体相同生物学功能的多克隆重链抗体,提示重链抗体可能在骆驼免疫防御中发挥重要作用。  相似文献   

14.
【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,MAbs)并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验(IFA)。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs(8F4、1D3、1H2、6C3和8E11)与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。  相似文献   

15.
 【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membrane protein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体 pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化,最终建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的HPS OMP5蛋白做抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为 1:400,血清的最佳稀释度为1:160。用建立的间接ELISA 方法检测317份未进行HPS免疫的健康猪血清,结果检出72份阳性,检出率为22.71%,与广东地区发病猪中的HPS分离率24%接近。同时,用该方法与用超声破碎抗原建立的ELISA方法同时检测了78份血清样品,结果,该法检出27份阳性,检出率为34.62%,后者则检出31份阳性,检出率为39.74%,二者符合率为71.79%。【结论】本研究利用重组表达的OMP5蛋白作为抗原建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 方法,特异性好、重复性好,检出率与HPS临床分离率接近,可用于副猪嗜血杆菌的临床检测、流行病学调查和免疫监控。  相似文献   

16.
 【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6~8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。  相似文献   

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