超声波辅助对农杆菌介导“美人指”葡萄遗传转化中GUS瞬时表达的影响

通过超声波辅助农杆菌介导法,优化"美人指"葡萄遗传转化体系。利用GUS瞬时表达的方法研究了不同功率、时间条件下的超声波处理,外植体类型以及AS浓度对"美人指"葡萄遗传转化效率的影响。结果表明:外植体茎段在含75mg/L AS农杆菌悬浮液中侵染4 min,并在此期间,用功率为90 W的超声波处理14 s,获得最佳GUS瞬时表达率42.8%。     

超声波辅助农杆菌介导转化大豆gus基因在不同外植体中的瞬时表达

研究以大豆品种东农42为材料,对胚尖、子叶节和下胚轴进行不同功率及作用时间的超声波处理,统计gus基因的瞬时表达频率.在超声波处理农杆菌侵染条件下,胚尖在80 W功率下处理3 min,gus基因表达频率达到最高,为87.5%.子叶节和下胚轴在48 W功率下处理5 min,gus基因瞬时表达频率均达到最高,分别为66.7%和75.0%.与常用的刀切处理相对比,超声波处理条件下,胚尖、子叶节及下胚轴的gus瞬时表达频率远高于刀切处理的外植体的gus瞬时表达频率,分别提高100.23%、73.25%、50%.     

农杆菌介导的胡麻转化因子的优化

农杆菌介导法是植物遗传转化的重要方法之一,为了提高农杆菌介导的胡麻遗传转化效率,以‘陇亚10号’和‘定亚22号’下胚轴为基因转化受体,以pCAMBIA3301为转化质粒,分析草铵膦选择压、下胚轴预处理(剥表皮、预培养)、农杆菌菌株、侵染时间和乙酰丁香酮对gus表达率/频率和抗性苗率的影响,优化以上转化因子参数,建立高效的胡麻遗传转化体系,为后续的胡麻功能基因组学研究和遗传改良奠定基础。结果表明:下胚轴愈伤组织诱导、分化和再生苗生根阶段的草铵膦选择压分别是10mg/L、5mg/L和2mg/L;下胚轴预处理对gus表达率/频率无显著影响,却显著影响抗性苗分化率,不剥表皮和预培养3d抗性苗率分别提高5倍和9倍;农杆菌菌株和侵染时间都显著影响gus表达率/频率和抗性苗率,C58c1侵染60min时gus表达频率最高,为7.5,抗性苗率为60.3%。乙酰丁香酮能显著提高C58c1和GV3101介导转化时gus表达频率。     

根癌农杆菌介导的苦瓜遗传转化

用含质粒载体pB I121的根癌农杆菌转化“南屿”苦瓜子叶节,通过对gus基因瞬时表达情况进行观测,对根癌农杆菌介导的苦瓜遗传转化体系相关因素进行研究.结果表明,苦瓜子叶节必须预培养3 d左右,用D600nm值为0.3-0.5之间的菌液浸泡,侵染时间为10 min,然后共培养3-4 d.再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到苦瓜基因组中.     

超声波辅助农杆菌转化OT百合‘罗宾娜’的研究

【目的】通过超声波处理辅助农杆菌转化OT百合小鳞片,提高农杆菌介导法转化百合的效率。【方法】以OT百合‘罗宾娜’(Lilium tenuifoliumoriental×tumpet‘Robina’)的再生小鳞片为外植体,分别以80W功率的超声波处理1,2,3,4,5min,通过超声波处理辅助根癌农杆菌进行外源基因的转化,同时以未进行超声波处理为对照;利用GUS组织化学法,分别检测转化脱菌后筛选培养7d的外植体和筛选培养60d后形成的潮霉素抗性再生植株叶片、小鳞片、根系的GUS瞬时表达和稳定表达,提取潮霉素抗性植株基因组DNA进行GUS和HPT基因的PCR扩增分析。【结果】超声波处理的农杆菌介导转化的百合外植体经GUS组织化学染色,多数可见蓝色斑点,且以3min超声波处理的蓝色最深;3min超声波处理的外植体对潮霉素的抗性率最高达48.85%,未经超声波处理的仅为15.56%,二者差异达显著水平。从53个潮霉素抗性再生植株的DNA样品中扩增得到了GUS基因和HPT基因的扩增片段,其中超声波处理3min的PCR阳性植株转化率最高,为28.30%,而未进行超声波处理的PCR阳性植株转化率仅为5.66%,初步证明外源基因可能整合到百合基因组中。【结论】20℃条件下80W功率超声波处理3min,可以有效提高农杆菌介导法转化OT百合的效率。     

超声波处理对根癌农杆菌介导转化金钗石斛影响的初步研究

以金钗石斛的类原球茎体（PLB6）为受体材料，研究了侵染前材料不同创伤处理对农杆菌介导转化频率的影响。结果表明：25KHz超声波40～80W处理5～10min或100W处理5min对PLBs死亡率无不良影响；1／2MS液体培养基适宜作为超声溶液；80～100W超声波处理5min的PLBs在转化后GUS染色每100mg鲜重材料上的蓝色斑点数由常规方法处理的0～0．54提高到6．05～7．90，GUS基因瞬时表达频率得到提高；筛选两个月后多数PLBs的GUS基因仍能稳定表达。说明超声波处理能提高农杆菌介导转化金钗石斛PLBs的频率。     

甘薯SAAT法遗传转化条件的优化

SAAT即声波辅助的农杆菌遗传转化方法。在遗传转化中,超声波处理可以在外植体上产生许多易于农杆菌进入的微小伤口和通道,从而提高转化率。该研究首次将SAAT法应用于甘薯遗传转化并对遗传转化体系进行优化,根癌农杆菌菌株为EHA101/pROA93(nptⅡ和gus),受体材料为甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞。结果表明,悬浮培养105 d,继代培养3 d,将经超声波处理30 s的胚性悬浮细胞侵染到OD600值稀释至0.5的对数生长期的EHA101菌液中10 m in,经4 d共培养后,GUS瞬时表达率最高,达到86.7%,稳定表达率为37.9%;转化时加入乙酰丁香酮亦能提高转化率;转基因植株筛选的适宜选择压为Kan 10 mg/L;适宜的抑菌剂为Carb 100 mg/L。     

农杆菌介导小麦遗传转化方法的优化与应用

为了优化农杆菌介导小麦遗传转化方法,以郑麦9023幼胚愈伤组织为材料,研究了60Coγ射线辐照对农杆菌介导法遗传转化的影响。结果表明,在辐照剂量为4 Gy,辐照处理后以继代培养24 h时β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因瞬时表达率最高。负压抽拉处理结果表明,抽拉10次可明显提高农杆菌介导的遗传转化效率。转基因抗性再生植株bar基因分子标记检测结果表明,利用改良的遗传转化处理方法(4 Gy辐照+辐照后培养24 h+负压抽拉处理10次),可将遗传转化效率由2.2%提高至3.5%,优化后的小麦农杆菌转化方法可应用于小麦遗传转化。     

农杆菌介导转化蝴蝶兰遗传体系的研究

为建立蝴蝶兰植株的高效遗传转化体系,以蝴蝶兰花梗腋芽诱导的类原球茎体为受体材料,利用农杆菌侵染并在侵染前后辅以超声波及负压处理的方法将gus基因导入到蝴蝶兰中,经过近90 d的筛选,获得了69个抗卡那霉素抗性PLB,经X-gluc组织化学染色法观察检测,表达率最高达39%,并获得了50株再生蝴蝶兰,其中17株PCR检测呈阳性。初步建立了蝴蝶兰遗传转化体系。另外,我们在农杆菌侵染前后辅以超声波及负压处理,可以提高转化效率。     

农杆菌介导小麦成熟胚体系的优化

针对转基因小麦成熟胚转化体系转化效率低,从提高成熟胚愈伤组织质量入手,调节小麦的基因型、成熟胚的培养时间、菌液浓度、侵染时间以及愈伤组织大小几个因素,提高成熟胚转化体系的转化效率;通过农杆菌介导,将目的基因转入到受体小麦成熟胚诱导的愈伤中,利用gus检测的方法检验转化效率;继代360d、自然生长5mm大小的受体小麦品种扬麦10,在菌液浓度OD600为0.8,侵染40min下,gus基因表达率达50%左右,接近幼胚的gus基因表达率。通过对体系的几个因素的调节,提高了农杆菌介导成熟胚转化体系的效率。     

提高植物农杆菌转化效率辅助策略研究进展

农杆菌介导是目前转基因植物研究采用的主要方法,不同植物间利用农杆菌转化的转化效率差异很大,高效农杆菌转化体系对于转基因植物产业化和功能基因组学等研究具有重要意义。总体而言,影响农杆菌转化效率的因素主要包括基因型、外植体及其生理状态、农杆菌菌株、培养基成分、共培养条件等。对于一些难转化的植物来说,辅助因素对转化效率的提高起着至关重要的作用。本文综述了影响农杆菌转化效率的一些辅助因素及其作用,包括植物材料微创伤处理和干燥处理、培养基中抗氧化剂和表面活性剂使用、农杆菌中额外拷贝Vir和植物细胞中VIP(VirE2 interacting protein)过表达、载体上核基质附着序列引入等,以期为进一步改进难转化作物如小麦、大豆等农杆菌介导的遗传转化效率提供参考。     

一种利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系的研究

[目的]利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系。[方法]利用电击转化法将iaaM基因的表达载体转入农杆菌LBA4404菌株中,通过花粉管通道法将验证正确的菌株直接转化京24玉米自交系,最后通过除草剂筛选及PCR检测得到阳性植株。[结果]试验共得到12株抗性植株,其中10株为阳性植株。[结论]该研究成功建立了一种无需组织培养体系,直接利用花粉管通道进行农杆菌介导的玉米转化方法。     

雪花莲凝集素基因转化新疆甜瓜抗蚜虫的研究

采用农杆菌介导法对新疆甜瓜进行了遗传转化研究,对影响转化频率的不同因素,即:抗生素浓度、预培养有无及感染时菌液的不同处理、外植体与农杆菌的感染时间和共培养时间等进行了研究,通过农杆菌介导法将雪花莲凝集素基因导入四日龄甜瓜子叶外植体,获得了卡那霉素的抗性植株.移栽成活并生长良好.卡那霉素抗性鉴定及转化株总DNA的PCR分析表明,GNA基因已整合到甜瓜的基因组中.初步抗蚜虫实验证明,转基因甜瓜有一定的抗棉蚜幼虫效果.     

农杆菌介导的甘蓝型油菜“中双11号”的遗传转化

[目的]研究农杆菌介导的甘蓝型油菜"中双11号"的遗传转化过程。[方法]选取甘蓝型油菜"中双11号"为材料,以萌发后5～7 d的无菌苗下胚轴为外植体,采用农杆菌侵染法,建立该品种油菜的转基因方法,分别在卡那霉素和Basta除草剂的条件下筛选再生植株,并用PCR和组织化学的方法对筛选出的再生植株进行分子鉴定。[结果]试验筛选到了阳性植株(T0),并于T1代植株中鉴定到了PCR阳性植株。[结论]该研究为我国油菜转基因技术的完善提供了依据。     

农杆菌介导的果树转基因研究进展

农杆菌介导法在果树遗传改良中有广阔的应用前景,农杆菌介导法的受体系统有原生质体、愈伤组织、直接分化芽和胚状体受体系统等;影响农杆菌转化频率的因素有侵染力,抗生素,基因型等;常用检测方法有GUS活性检测,PCR技术,杂交检测,免疫学检测.从农杆菌介导法在果树中的各种转化受体系统、影响果树基因转化的主要因素和转化植株的检测等方面进行综述,为不同果树建立高效的基因转化体系提供参考.     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。     

玉米规模化转基因技术体系构建及其应用

玉米是世界种植范围最广、产量最高的粮食作物,为保证世界粮食安全做出了重要贡献。但是病虫害、杂草、干旱、盐碱等生物或非生物胁迫严重影响了玉米生产。培育具有抗虫、抗除草剂、抗病等性状的转基因玉米品种并应用到实际生产中,能够减少玉米产量损失,减少农药化肥使用量。玉米规模化转基因技术体系研究发展迅速,获得的抗虫、抗除草剂转基因玉米已在国外商业化种植18年,带来巨大的经济、社会和生态效益。全球转基因作物种植面积从1996年的170万公顷增加到2013年的1.75亿公顷。转基因玉米新品种培育需要较成熟的玉米规模化转基因技术体系。目前,商业化种植的转基因玉米都是从大量转基因玉米中选择的,具有外源基因单拷贝插入、遗传稳定、无载体骨架插入、目的基因表达合适、对玉米自身性状无影响等特点。国外大公司及部分公立研究机构建立了相对成熟的玉米转基因技术体系。中国玉米转基因技术体系研究起步较晚,目前初步建立了玉米规模化转基因技术体系,有必要进一步提高玉米遗传转化效率及规模化程度。玉米规模化转基因技术体系采用的主要方法是基因枪法和农杆菌介导法。文章详细介绍了2种方法的原理、发展过程及其应用。农杆菌介导法是目前最主流的植物遗传转化方法,具有成本低、外源基因拷贝数低、外源基因能稳定遗传表达等特点,更适用于规模化转基因技术体系。中国在玉米转基因技术体系研究及应用方面有很好的进展,在转基因受体材料选择、农杆菌侵染方法优化等方面对农杆菌介导的玉米遗传转化方法进行了系统优化,以国际上常用的玉米杂交种HiII及中国玉米优良自交系综31等为转化受体,建立了基于幼胚的玉米规模化转基因技术体系,并很好地应用于转基因玉米新品种的创制,获得大量具有生产应用价值的抗虫、抗除草剂转基因玉米。文章展望了玉米转基因技术体系的发展趋势,认为商业自交系作为外植体的筛选、转化事件单拷贝率的提高、无载体骨架序列转基因的提升、多基因转化技术、基因打靶技术、基因编辑技术及安全转化技术等方面是玉米转基因技术发展的趋势。中国应紧跟玉米转基因技术发展趋势,大力发展多基因转化技术、基因打靶技术及安全转化技术,使转基因玉米技术体系更好地服务于基因功能研究、转基因玉米产品研发等。中国通过玉米规模化转基因技术体系获得的转基因玉米将来进入产业化应用,将带来巨大的经济效益、社会效益和环境效益,并将推动玉米转基因技术体系的进一步发展。文章为玉米转基因技术体系优化和转基因玉米新材料获得等方面的研究提供一定的参考。     

Scarabaeid Larvae- and Herbicide-Resistant Transgenic Perennial Ryegrass (Lolium perenne L.) Obtained by Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of cry8Ca2, cry8Ga and bar Genes

Insect pest and weeds are two major problems for forage and turf grasses. In this study, scarab larvae- and herbicideresistant transgenic perennial ryegrass (Lolium perenne L.) was obtained by transforming it with cry and bar genes simultaneously via the Agrobacterium-mediated method. To optimize the callus induction and plant regeneration conditions, various concentrations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 6-benzylaminopurine were assayed. The transformation efficiencies of different Agrobacterium suspension media, used during Agrobacterium-mediated transformation, were compared. Then, plasmids of pCAMBIA3301 containing cry gene (cry8Ca2 or cry8Ga) and bar gene, driven by ubiquitin promoter, were transformed into perennial ryegrass. The transformants were generated and confirmed by both Southern hybridization analysis and Western hybridization analysis. Further, the resistance of transgenic perennial ryegrass plants to scarab larvae and herbicide were analyzed. After 30 d of co-cultivation with scarab larvae, the damage to the root system of transgenic plants was less than that of non-transgenic control plants. Additionally, the leaves of transgenic plants were resistant to Basta®, while leaves of the wild plants wilted after Basta® spraying. These results show that cry gene and bar gene were successfully transferred into perennial ryegrass by the Agrobactgerium-mediated method, and convey resistance to scarab larvae and herbicide in transgenic perennial ryegrass plants.     

参与农杆菌侵染及T-DNA转运过程植物蛋白的研究进展和思考

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤病原细菌,携带具有天然转基因功能的Ti质粒或Ri质粒,能将一部分遗传物质插入到寄主植物的染色体上,使其稳定遗传和表达,赋予植物新的性状。所以农杆菌作为最有效的转化媒介,已被广泛应用于多数双子叶植物和部分单子叶植物转基因研究。虽然农杆菌介导的转化技术具有操作简单、成本低廉,转基因沉默几率小,插入基因拷贝数少等优点,但农杆菌介导植物遗传转化是一个复杂的生物学过程,需要一系列农杆菌蛋白和植物蛋白相互作用,共同完成外源基因的转入和整合。植物相关蛋白在转化过程中起着重要作用。其中,阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)、植物根钙粘附蛋白和类玻连蛋白等参与农杆菌附着于植物细胞表面的过程;鸟苷三磷酸腺苷酶（GTPase）和BTI蛋白协助T-DNA和Vir效应蛋白进入植物细胞;actin、GIP、VIP等蛋白参与T-DNA复合体在细胞质中的运输的过程;与Vir效应蛋白互作的VIP1、VIP2、KAPa、PP2C、Roc等蛋白协助T-DNA定位于植物细胞核;组蛋白、VIP1和VIP2等引导T-DNA在植物基因组上的整合。由于植物种类间存在巨大差异,上述一些植物蛋白基因的过表达虽能提高农杆菌转化某些植物的转化效率,但不能提高另一些植物的转化效率。在容易被农杆菌遗传转化的植物如拟南芥、水稻中的研究表明,VIP1、VIP2、AGP、H2A等蛋白与农杆菌转化关系密切,但这些蛋白在利用农杆菌转化较难的作物如小麦、玉米中的功能还不明确,因而需要在不同植物中继续筛选和鉴定与T-DNA转化相关重要蛋白的编码基因。目前,农杆菌介导的植物遗传转化有2个显著特点,一是农杆菌介导转化烟草、拟南芥、水稻等模式植物的技术日渐成熟,二是农杆菌介导转化小麦、玉米、大豆等重要作物的技术仍然没有本质突破,植物相关蛋白在T-DNA转运、整合等过程中的作用还需要深入研究和进一步明确。文章主要对参与农杆菌介导遗传转化植物整个过程中相关植物蛋白的研究进展进行了综述,以期为提高农杆菌转化顽拗型作物的转化效率提供参考。