牛体外发育卵母细胞成熟的评估方法研究

为探讨不同评估方法对牛卵母细胞体外成熟的判定效果,以牛卵丘卵母细胞复合体(COCs)为试验材料,采用比较卵丘扩展、形态学观察第一极体排出和固定染色观察第一极体3种方法评估牛卵母细胞成熟率的差异.结果表明,牛卵母细胞经体外24 h成熟培养后,卵丘扩展分级的成熟率为76.8％,形态学观察第一极体排出率为71.2％,固定染色观察第一极体核成熟率为77.1％,3种判定方法评估成熟率无显著差异(P＞0.05).因此,3种方法均可用于卵母细胞的体外成熟判定.     

组织切片法观察昆明白小鼠卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系①

本实验应用组织切片法探讨了体内正常生理条件下昆明白小鼠卵巢内卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系。初情期前小鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG）,48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）,于注射HCG后不同时间取出卵巢进行组织切片。注射HCG后1 h,卵丘细胞开始扩展,此时卵母细胞核膜完整,即未发生生发泡破裂（GVBD）;注射HCG后3 h,大部分(＞70%)大有腔卵泡中卵母细胞发生GVBD,此时卵丘处于2级扩展状态。卵丘完全扩展发生在注射HCG后9 h,而PB1的排出是从12　h开始的。结果表明在小鼠体内,卵丘开始扩展先于卵母细胞成熟,但卵母细胞成熟并不需要卵丘完全扩展;促性腺激素能促进卵泡发育及卵母细胞成熟,同时也具有促使卵泡退化的功能。     

不同品系小鼠体外受精方法的研究

对CD-1、B6DF1和C57BL／6小鼠的卵母细胞采用直接、去卵丘细胞、切割透明带法处理后,分别进行体外受精、体外培养和胚胎移植试验。结果表明：CD-1和B6DF1小鼠体外受精率及受孕率均高于近交系C57BL／6小鼠。3个品系小鼠卵母细胞3种不同处理试验,受孕率差异均不显著;去卵丘细胞卵体外受精率(11％～23％)均显著低于卵丘卵母细胞复合体的受精率(34％～60％)和切割透明带卵的受精率(48％～65％),而C57BL／6小鼠的卵经切割透明带后体外受精率显著高于卵丘卵母细胞复合体的受精率。C57BL／6小鼠理想的体外受精方法为切割透明带法,而CD-1、B6DF1小鼠切割透明带卵受精率与其卵丘卵母细胞复合体的受精率差异均不显著,因此这2个品系可直接用卵丘卵母细胞复合体进行体外受精,其方法简单、有效。     

受精液种类、卵丘细胞及卵巢保存温度对奶牛体外受精效果的影响

为了提高奶牛体外受精效果,研究了体外成熟卵母细胞在IVF-100、BO和TALP三种体外受精液中的受精效果,同时比较了裸卵(NOs)与卵丘卵母细胞复合体(COCs)对受精效果的影响,卵巢的不同保存温度对卵母细胞受精效果的影响。结果显示,体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率显著高于BO液的(P0.05),而TALP液中的卵裂率与IVF-100和BO液的差异都不显著(P0.05);裸卵(NOs)的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体(COCs),但差异不显著(P0.05);NOs的囊胚率极显著低于COCs的(P0.01);卵巢在10和37℃下保存2~3 h,卵母细胞卵裂率和囊胚率差异均不显著(P0.05)。     

猪极体的排出与退化规律及其活性保存

哺乳动物卵母细胞二次减数分裂分别产生第一极体(PbⅠ)和第二极体(PbⅡ),极体(Pb)含有与卵母细胞相似的遗传物质。为探索猪Pb的排出与退化规律,并建立有效的Pb保存方法,从屠宰后的母猪卵巢中采集卵母细胞进行体外成熟培养及体外受精,分别对PbⅠ和PbⅡ的排出与退化规律及其在不同保存温度下的存活情况进行研究。结果表明:PbⅠ在卵泡卵母细胞体外培养40 h时排出率最高,PbⅠ在39℃条件下保存6 h形态正常率为85.5%,但存活率只有18.2%,4℃保存40 h存活率为85.0%,-20℃保存168 h存活率为95.0%,-196℃超低温保存1 344 h存活率和形态正常率分别达89.1%和97.8%。PbⅡ在卵母细胞受精后20 h排出率最高,PbⅡ在39℃条件下保存16 h形态正常率为69.0%,但存活率只有34.5%,4℃保存30 h存活率为87.5%,-20℃保存240h存活率为84.6%,-196℃超低温保存1 344 h存活率和形态正常率分别达87.0%和95.7%。     

猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟关系的研究

 以猪卵丘卵母细胞复合体（COC）为实验对象研究了猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟之间的关系,结果表明,（1）全程培养均暴露于激素环境中不利于卵丘的扩展;（2）卵丘扩展良好与卵丘扩展不好的卵母细胞核成熟比例无统计学差异（P>005）;（3）去除卵母细胞的COC培养后,卵丘细胞仍然能发生扩展;（4）培养24h后去掉COC的卵丘细胞不仅不影响卵母细胞的核成熟,而且极体完整的卵母细胞数目还显著增多（P<0.01）;但去颗粒细胞组卵母细胞的质膜不如对照组光滑;（5）带有壁颗粒细胞（mural granulosa cell,MGC）的COC扩展情况明显优于不带MGC的,其中含有极体的成熟卵数也显著高于后者（P<0.01）。     

卵巢运输保存温度和时间对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响

以屠宰日本北海道野生梅花鹿(Cervus nippon Temminck)卵巢为材料,研究了卵巢不同保存温度(20～25 ℃,10～15 ℃)和时间(12 h,24 h)及卵母细胞周围的卵丘细胞层对卵母细胞体外成熟的影响.结果表明,卵巢在20～25 ℃下保存12 h,卵母细胞成熟率为77%,无变形卵子出现,但其保存时间延长到24 h时,卵母细胞成熟率降至35%,变形率高达62%;而在10～15 ℃下保存12 h,卵母细胞成熟率为45%,卵母细胞变形率为18%,但10～15 ℃保存24 h与20～25 ℃保存24 h相比,卵母细胞变形率却很低(35%,62%)(P<0.05).周围卵丘细胞层3层以上和少于3层的卵母细胞中,48%～53%的受精卵都能正常地卵裂,但前者获得了13%的囊胚率,后者未发育至囊胚(P<0.05).     

猪卵母细胞极体排出的规律

试验把猪卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,观察它们在不同时间排出的极体数,以研究体外卵母细胞排出极体的规律.结果表明,A级和B级的COCs培养48 h的极体排出率最高(83.2％和65.7％),明显高于同级水平培养24...     

体内制抑一氧化氮合成酶对小鼠卵母细胞成熟和排卵的影响

实验研究了一氧化氮合成酶抑制剂L－NAME对昆明白小鼠卵母细胞成熟和排卵的影响。初情期前的昆明小鼠注射PMSG促进发情，注射hCG促进排卵，并在注射hCG前后各3h注射L－NAME。注射hCG后18h颈椎脱臼处死小鼠，取输卵管冲卵。统计排卵数及卵母细胞的减数分裂情况发现，注射L－NAME后排卵数明显减少，卵母细胞减数分裂恢复异常，大部分排出的卵母细胞处于MI期；PB1的排出率降低，形态异常或退化死亡的卵母细胞数增加。结果直接证明：在体内，NO可促进小鼠卵母细胞的减数分裂的恢复；NO对于小鼠排卵具有重要的促进作用；NO对小鼠卵母细胞质的成熟有重要影响；抑制NO合成后，卵母细胞减数分裂发生异常。     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

卵细胞的发生和调控

卵细胞在卵巢中进行减数分裂的过程叫作卵的发生,这个过程包括增殖期、生长期以及成熟期3个阶段.卵泡的发生包括卵泡的募集、选择和优势化,对于卵泡在发育的过程中出现这3个阶段的机理研究尚不是很清楚.卵泡发生的调节机制非常复杂,在此重点研究卵巢局部因子对卵母细胞发育的影响以及卵泡各结构间的相互影响,卵母细胞发育的过程中也出现了超微结构的改变.     

马鹿卵母细胞的超微结构研究

目的通过对马鹿卵母细胞的超微结构进行研究,旨在为马鹿繁殖育种的研究提供基础理论依据。方法用FSH对母马鹿进行超数排卵,采用抽吸法和切割法采集卵母细胞,利用透射电镜观察其超微结构。结果在光镜下,马鹿卵母细胞的平均直径为172.958±17.298μm,卵丘细胞厚度为67.750±33.107μm,透明带厚度为13.782±2.516μm。电镜下,卵母细胞外的卵丘细胞紧紧包裹卵母细胞,且与卵母细胞之间有大量细长的微绒毛相联系;卵丘细胞核呈卵圆形,其长径为4.250±0.042μm,短径为2.750±0.071μm;透明带均匀,与卵母细胞结合紧密;在皮质区集中分布大量的多嵴型线粒体、脂滴和空泡,线粒体长径为0.600±0.106μm,短径为0.490±0.117μm;细胞核中颗粒状的核质分布非常均匀。     

乙醇和电场激活小鼠早期卵母细胞的研究

分别用７０ｍＬ·Ｌ－１乙醇２ｍｉｎ和５５Ｖ·ｍｍ－１电场６４０μｓ一次脉冲,对注射ｈＣＧ１５ｈ的小鼠卵母细胞作激活处理。结果表明：虽然乙醇处理的活化率（５５．４０％）略高于电刺激（４６．９０％）,但二者没有显著差异;与乙醇比较,电激活的卵母细胞能保持良好的发育能力,二者的桑椹胚发育率分别为３１．５１％和９１．３７％,差异极显著（Ｐ＜０．０１）．说明电场作用后卵母细胞的活动更符合其正常的活化规律。     

玻璃化冷冻保存牛卵母细胞技术研究

采用一步法和二步法研究玻璃化冷冻保存的牛生发泡 (GV )期和体外成熟 (IVM)卵母细胞的发育潜力。结果表明 ,冷冻基础液 PBS和 TCM199在玻璃化冷冻中的效果差异不显著 (P>0 .0 5 ) ;冷冻程序和卵母细胞发育阶段对冷冻效果有明显影响 ,二步法冷冻效果显著优于一步法 (P<0 .0 5 ) ,IVM卵母细胞冷冻效果显著优于GV期 (P<0 .0 5 )。     

培养过程中温度对猪卵母细胞发育的影响(脂滴部分)

猪成熟的卵母细胞在体外20℃和37℃的条件下,以M—199为培养基,以未培养的卵母细胞做对照,分别培养24和48小时,观察和分析不同温度下猪卵母细胞的发育以及超微结构的变化。结果表明,不同温度对细胞内脂滴的数量没有影响,对脂滴内容物的致密度无显著影响,但对脂滴大小有影响。与对照组比较,实验组的脂滴明显增大。在37℃培养时,脂滴的大小与时间呈正比,20℃时,则先增大后缩小。形态上的差别:20℃培养时一些细胞的部分脂滴出现相变现象,未见脂滴的外排;37℃时脂滴的变化不同。猪卵母细胞不耐低温,可能由于猪卵母细胞含有大量脂类,低温时由液晶态的脂类变成晶态,使细胞失去正常功能,甚至死亡。     

山羊卵泡卵母细胞低温冷冻保存研究

通过对冷冻液(1,2—丙二醇浓度和冷冻基础液)以及平衡和脱去防冻剂方法的筛选,研究了山羊卵泡卵母细胞的低温冷冻保存的可能性。结果表明,当冷冻液为含有10％1,2—丙二醇的生理盐水,并以五步法平衡和脱去防冻剂时,冷冻效果最为有效。解冻后,卵泡卵母细胞的回收率和形态正常率分别为96.6％(56/58)和75.8％(44/58),形态正常卵泡卵母细胞的成熟率为16.3％(2/12)。     

绵羊不同直径卵泡卵母细胞特征及染色体形态分析

[目的]剥离不同直径卵泡卵母细胞,比较卵母细胞成熟前后的特征.[方法]测量绵羊卵巢表面卵泡直径后进行剥离,研究卵泡表面直径与卵泡实际直径之间的关系.按表面直径分组(1.0 mm以下、1.0～2.0mm、2.1～4.0 mm、4.1 mm以上),比较各分组间卵母细胞透明带厚度、卵丘复合体质量、卵母细胞成熟前后的染色体形态变化的差异.[结果]随着卵泡直径的增大,卵泡实际直径差异极显著(P＜0.01);各组间透明带厚度差异不显著(P＞0 05),但有降低的趋势;卵丘复合体质量分为A级、B级和C级,A级有增加的趋势,B级C级有降低的趋势;卵母细胞成熟后GV/GVBD比率有下降的趋势,MAT -I、NII有增加的趋势.[结论]随着卵泡直径增大,未成熟卵母细胞的质量提高,卵母细胞核成熟比例增加.     

山羊卵子发育、受精和老化过程的电镜组化研究

应用改良柠檬酸铅法、Tris-Malcate法和Dermer氏保存磷脂的固定方法,分别研究了山羊卵母细胞发育、受精和老化过程中硷性磷酸酶(Alpase)、酸性磷酸酶(Acpase)和磷脂的超微结构定位和含量。结果表明,a.碱性磷酸酶主要定位于MV.卵皮质和伸入到卵母细胞内的颗粒细胞突起上;生长卵母细胞的硷性酸酶活性很强,排卵后活性减弱,受精卵中无Alpase活性。b.排卵24小时后卵母细胞内开始出现Acpase阳性的髓样小体,并随卵老化而逐渐增多。c.卵母细胞脂滴内磷脂含量很少,且恒定;MV、ZP、质膜和Mi上都含有许多磷脂;生长卵母细胞MV和质膜上磷脂多,排卵后减少;受精卵质膜和Mi膜上磷脂明显增多。文中讨论了酶和磷脂变化与卵母细胞生理状态的关系。     

山羊卵母细胞成熟的超微结构研究

应用光、电镜技术研究山羊排卵后和体外成熟培养后的卵母细胞的形态学变化。结果表明：排卵后４ｈ的输卵管卵母细胞和体外培养２４～２６ｈ的卵泡卵母细胞已具有充分成熟（获能）的形态学特征，卵周隙大，微绒毛竖起，ＭⅡ纺锤体长轴在质膜下呈垂直状，最大数量的皮质颗粒呈线形排列在质膜下，线粒体散在分布。本研究结果为山羊卵母细胞体外成熟和体外受精最佳时期提供了可靠的形态学依据。     

促卵泡素对犬卵母细胞体外成熟的影响

为探究基础培养基中添加促卵泡素(FSH)对犬卵母细胞体外成熟的影响,采用切割法收集卵巢表面的卵丘卵母细胞复合体(COCs),培养在添加不同浓度FSH(0,0.1,1,10 IU/mL)的TCM-199基础培养液中.体外培养72 h后,对卵母细胞进行染色观察其细胞核成熟情况.结果表明,FSH的添加没有增加犬卵母细胞恢复减数分裂的细胞数量.此外,不同处理对卵母细胞卵丘扩散无差异.