重组凝乳酶摇瓶发酵条件的初步优化研究

凝乳酶是一种酸性蛋白酶,用作动物饲料添加剂,可提高动物特别是幼龄动物对饲料中蛋白成分的消化吸收率,促进其生长。本试验研究了由毕赤酵母胞外表达多拷微小毛霉凝乳酶的摇瓶发酵条件。确定最佳表达条件为：甲醇每24 h添加1.0%,无氨基酵母氮源培养基（YNB）添加1.5%,采用pH6.0的磷酸缓冲液,诱导120 h,在此条件下,重组凝乳酶的产量可达6 500 IU/ml。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

微小毛霉凝乳酶的制备工艺

以食用菌菌糠和豆渣1∶1 (w/w)混合物作为微小毛霉固体发酵培养基,探讨微小毛霉凝乳酶粉末制剂的制备工艺.制备过程包括:三角瓶固体发酵、加水提取、Al2 (SO4)3絮凝、微滤除菌、超滤浓缩、室温醇沉、40℃真空干燥等7个步骤.结果显示:凝乳酶在水溶液中的热变性为52℃左右,而在70％含水酒精中的变性温度则降至35℃...     

微孢根霉产凝乳酶的发酵条件优化

筛选得到一株高产凝乳酶的菌株F518,鉴定为微孢根霉。通过单因素试验优化了微孢根霉F518液体发酵产凝乳酶的发酵条件。结果表明:发酵产酶的最适碳源为酒糟,最适氮源为酵母浸粉,培养基最适初始pH为5.0。在优化后的发酵条件下30℃培养72h,微孢根霉F518产凝乳酶活性最高,达到1 001SU/mL。微孢根霉F518在凝乳酶生产方面有很大的应用前景。     

微小毛霉凝乳酶干酪素的制备及应用性能研究

以新鲜牛奶为原料,采用自制微小毛霉Mucor Pusilius凝乳酶作为脱脂牛奶凝固剂,经过离心脱脂、巴氏杀菌、凝乳、热烫、离心脱乳清、水洗、干燥、粉碎过筛等步骤获得凝乳酶干酪素,考察工艺参数对干酪素得率及应用性能的影响.实验结果表明,凝乳酶添加量、凝乳pH值、热烫温度对凝乳酶干酪素得率无显著影响,热烫温度对产品的融化...     

西农萨能羊凝乳酶原基因的克隆与原核表达

【目的】克隆西农萨能羊凝乳酶原基因并进行原核表达,对表达产物凝乳酶原复性后进行活性检测,为西农萨能羊凝乳酶制剂的微生物发酵生产奠定基础。【方法】从西北农林科技大学西农萨能羊原种场新生公羔羊的皱胃组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶基因全长编码区序列。将该基因连接到原核表达载体pET-30a中,构建重组菌pET-30a/Chymosin,经酶切、测序鉴定后进行凝乳酶的小量表达、大量表达、Western杂交鉴定、纯化、复性和活性测定。【结果】通过RT-PCR方法获得了西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,并构建了重组菌pET-30a/Chymosin;通过体外原核表达获得了西农萨能羊凝乳酶原,将酶原进行复性后测得重组菌酶活力为93.2U/mL。【结论】利用西农萨能羊凝乳酶原基因,通过构建原核表达载体和体外表达可以得到凝乳酶原,通过蛋白纯化和复性可得到有活性的凝乳酶。     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在毕赤酵母中的表达

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,将其克隆至酵母表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115中.重组菌株GS115/pPIC9K-LI经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳表明该基因在酵母中得到表达,即分子量约为67 kD的重组LI蛋白.经SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度为95%的重组LI蛋白样品.气相色谱分析表明,纯化的重组LI具有亚油酸异构酶的活性,酶的比活力为6.8 U·mg-1.     

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究

 【目的】对辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcpme3基因进行真核表达,制备其特异性抗血清,为用Western blot检测该基因在辣椒疫霉致病过程中的功能奠定基础。【方法】利用TR-PCR分离鉴定Pcpme3的成熟肽片段,克隆于pPIC9K载体。将获得的表达载体转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和免疫家兔制备特异性抗体。【结果】酵母转化子经MD、MM平板筛选和G418抗生素筛选与PCR鉴定,获得Mut+/His+表型高拷贝重组转化子,经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵上清液,检测出43 kD的特异蛋白。重组蛋白免疫家兔制备特异抗血清,Western blot检测该基因在游动孢子侵染辣椒叶片中的表达,随着病情加重,该基因的表达逐渐增强,从而证明该基因参与了病菌的侵染致病过程。【结论】利用真核表达获得的蛋白制成特异性抗体可以有效地检测Pcpme3在辣椒疫霉侵染寄主过程中的功能特性。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

兔支气管败血性波氏杆菌fimN基因的原核表达

应用PCR方法扩增兔支气管波氏杆菌(Bb)的菌毛蛋白基因(fimN),将fimN基因克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET28a-fimN。将此重组质粒转化受体菌BL21后,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白分子量大小约为27 kD,与理论预期值相符。用Western-blot试验分析纯化的表达产物,结果表明,该重组蛋白能与Bb阳性血清发生特异性反应。     

Web2.0,以个人为中心的互联网时代的到来

本文介绍了Web2．0的知识和背景，对Web2．0出现的基础以及典型技术和应用作了阐述，同时对其作出了前景展望。     

市级综合气象信息分析与管理系统的设计与实现

以抚顺地区3个国家基本站50余年气象资料为依托，采用Microsoft Excel工作表实现由气候和农业气候2部分构成的气象与农业综合信息处理系统的基本思路、方法、内容、用途和使用情况。为了实现气候分析及应用的科学化、客观化、系统化、规范化、程序化及连续化的业务目标，按业务流程设计与实现的，包括资料处理、气候趋势模拟、气候预测、气候鉴定、季节性信息化处理、农作物产量预报、气候生产潜力分析等一系列内容在内的系统建设。关键是解决了大量的计算问题，建立了区域性通用模式。     

Multi-variable grey model (MGM (1,n,q)) based on genetic algorithm and its application in urban water consumption

Urban water consumption has some characteristics of grey because it is influenced by economy, population, standard of living and so on. The multi-variable grey model （MGM（1,n））, as the expansion and complement of GM（1,1） model, reveals the relationship between restriction and stimulation among variables, and the genetic algorithm has the whole optimal and parallel characteristics. In this paper, the parameter q of MGM（1,n） model was optimized, and a multi-variable grey model （MGM（1 ,n,q）） was built by using the genetic algorithm. The model was validated by examining the urban water consumption from 1990 to 2003 in Dalian City. The result indicated that the multi-variable grey model （MGM（1,n,q）） based on genetic algorithm was better than MGM（1,n） model, and the MGM（1,n） model was better than MGM（1,1） model.     

Molecular detection of virulence genes in Campylobacter species isolated from livestock production systems in South Africa

Campylobacter species are a major cause of foodborne bacterial infections in both developed and developing countries worldwide. Campylobacter jejuni is responsible for the majority of infections. This study was conducted to identify virulenceassociated genes in Campylobacter species isolated from livestock production systems in South Africa. A total of 250 fecal samples consisting of cattle(n=50), chickens(n=50), goats(n=50), sheep(n=50) and pigs(n=50) were randomly collected from livestock in Eastern Cape and KwaZulu-Natal provinces of South Africa between April and October 2018. The samples were analyzed for the presence of virulence genes in Campylobacter species using molecular PCR-based methods. It was found that 77 and 23% of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli respectively were isolated from all the livestock samples. There were positive significant(P0.05) correlations amongst all the virulence genes that were investigated. Chisquare and Fisher's exact tests were implemented to test for the effect of livestock species on the presence or absence of virulence genes. The study demonstrated that most of livestock species can potentially cause zoonotic infections and food poisoning due to the high prevalence of Campylobacter. The high prevalence of virulence genes highlights the significance of Campylobacter in livestock production systems in South Africa. This requires the implementation of one-health approaches to reduce the impact of foodborne and zoonotic diseases for the welfare of human and animal health.     

不同施肥水平对木薯氮磷钾养分积累、分配及其产量的影响

 【目的】通过比较不同施肥水平下木薯氮磷钾养分积累、分配和产量的差异，探讨粤北坡岗地优质高产木薯氮磷钾养分的最佳用量。【方法】以木薯品种南美119为材料，采用“3414”方案，在粤北翁源进行大田试验。试验共设14个处理。【结果】施肥处理的氮素主要分配到地上部，不施肥处理的氮素则主要分配到根部；不同施肥处理的磷素均主要分配到地上部；不施肥处理和不施钾处理的钾素主要分配到根部，不施氮处理的钾素在根、冠间分配较均衡。在木薯不同生长阶段，植株氮磷钾含量均呈下降趋势，但施氮、磷、钾化学肥料处理植株氮磷钾含量的下降速度小于不施氮、磷、钾化学肥料的处理。处理N2P2K2的氮、磷、钾含量和积累量在各生育期均为最大，不施肥处理（N0P0K0）的氮、磷、钾含量和积累量在各生育期均为最小（P＜0.05）。产量最高的是N2P3K2处理，为22 694.06 kg·hm-2，其次是N2P2K2处理，为21 417.87 kg·hm-2。【结论】木薯产量、氮磷钾养分积累及其在根冠间的分配，对施肥水平高度敏感, 适当比例的氮磷钾肥配合施用既可以显著增加木薯植株的氮磷钾含量和积累量，又可以提高产量。在粤北坡岗地木薯生产中，氮素最重要，在氮素得到满足的条件下，磷素较钾素更重要。在本试验条件下，氮磷钾养分最佳用量为358.80 kgN·hm-2、89.10 kg P2O5·hm-2和187.50 kg K2O·hm-2。     

红苕饲粮中添加铜和/或喹乙醇对猪生产性能及某些血液生化指标的影响

选体重约38公斤的长白(♂)×成华(♀)杂交猪20头,随机分为四组,饲予四种不同的饲粮,研究饲粮中添加铜和/或喹乙醇对猪生产性能和某些血液生化指标的影响。结果表明:基础组、加铜组、加喹乙醇组和两者同时加组全期日增重分别为674、761、796、678克,日采食量分别为2.50、2.65、2.74、2.40公斤,饲料利用率分别为3.73、3.49,3.44、3.54,添加铜和/或喹乙醇对试验第65天血清铜兰蛋白、尿素氨及屠宰率、背膘厚和眼肌面积无显著影响(p>0.05);添加铜使65天血清碱性碱酸酶活性极显著增高(p<0.01),添加喹乙醇有使之升高的趋势,两者同时添加时,碱性酸磷酶活性降低。     

Current progress on genetic interactions of rice with rice blast and sheath blight fungi

Analysis of genetic interactions between rice and its pathogenic fungi Magnaporthe oryzae and Rhizoctonia solani should lead to a better understanding of molecular mechanisms of host resistance, and the improvement of strategies to manage rice blast and sheath blight diseases. Currently, dozens of rice resistance (R) genes against specific races of the blast fungus have been described. Among them, ten were molecularly characterized and some were widely used for breeding for genetic resistance. The Pi-ta gene was one of the best characterized rice R genes. Following the elucidation of its molecular structure, interaction, distribution, and evolution, user friendly DNA markers were developed from portions of the cloned genes to facilitate the incorporations of the Pi-ta mediated resistance into improved rice varieties using marker assisted selection (MAS). However, rice blast is still a major threat for stable rice production because of race change mutations occurring in rice fields, which often overcome added resistance based on single R genes, and these virulent races of M. oryzae pose a continued challenge for blast control. For sheath blight, progress has been made on the exploration of novel sources of resistance from wild rice relatives and indica rice cultivars. A major quantitative trait locus (QTL), named qSB9-2, was recently verified in several mapping populations with different phenotyping methods, including greenhouse methods. The ability to identify qSB9-2 using greenhouse methods should accelerate the efforts on the qSB9-2 fine mapping and positional cloning.     

仙人掌超氧化物歧化酶提取与纯化研究

以仙人掌为试验材料,采用硫酸铵分级沉淀法得到超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）粗酶液。然后用Sephadex（葡聚糖凝胶）G-75层析柱层析对粗酶液进行进一步纯化,最后用邻苯三酚法测定酶活力,并对酶活力主要影响因素（包括pH值、温度、抑制剂）进行了研究。结果显示仙人掌SOD酶比活力为751.56U.mg-1。pH值为7.5~8.5时酶活力最大,稳定性也好。温度维持在25~30℃时酶活力最高。由于过氧化氢和氰化钾均能使仙人掌SOD的酶活力显著下降,因而可以初步判断从仙人掌中提取到的SOD是Cu.Zn-SOD。     

锌对镉·汞复合污染下豌豆幼苗生长的影响

以豌豆为试验材料,采用水培方法研究了锌对镉、汞复合污染下的豌豆种子萌发与生长的影响。结果显示,锌浓度≤100.0 mg/L时促进豌豆种子的萌发,锌浓度为200.0和300.0 mg/L时抑制豌豆种子的萌发。当镉、汞的浓度为3.0 mg/L时,100.0 mg/L锌的解毒效应最明显,表现为能够促进镉、汞胁迫下豌豆种子萌发和幼苗生长,降低豌豆幼苗根尖细胞畸变率,提高豌豆幼苗的叶绿素含量及过氧化物酶活性;但当锌浓度≥200.0 mg/L时,与镉、汞协同迫害豌豆幼苗的生长。     

HPLC测定猪肉食品中四环素族抗生素残留

[目的]建立一种采用高效液相色谱（HPLC）测定肉类食品中四环素族抗生素残留量的新方法。[方法]首先,用Na2EDTA-McIl-vaine缓冲溶液提取样品,并用三氯乙酸除去其中的蛋白质;然后,用HLB固相萃取柱进行净化;最后,采用高效液相色谱仪测定含量,并用外标法定量。[结果]Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液的pH值为4.5时,四环素族抗生素回收率最高,最大吸收波长为355 nm,最低检测限为100μg/L。3个添加水平的回收率均在68.5%-94.7%,相对标准偏差为2.5%-9.1%。[结论]该方法简便、快速、准确、精密度高,适用于肉类食品中四环素族抗生素残留量的检测。