苹果叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

以苹果品种嘠拉试管苗为试材,研究了卡那霉素(Km)、潮霉素(Hm)对继代苗生长和离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)对苹果离体叶片再生的影响及对农杆菌EHA105和LBA4404的抑菌效果;以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。结果表明:Km10mg/L、Hm4.0mg/L完全抑制了叶片不定芽的分化,可作为苹果叶盘法转化时抗性芽的选择压;Km50mg/L、Hm5.0mg/L达到继代苗的半致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度;由于抗性芽再生的选择压与抗性苗筛选浓度相差较小,Hm相对于Km更适合作为苹果基因转化的选择标记;培养基中附加Cef300mg/L能完全抑制农杆菌生长,对叶片不定芽的再生影响不大;而附加Carb则需400mg/L以上才能抑制农杆菌生长,同时严重抑制了叶片再生。因此,宜选用Cef作为苹果基因转化的抑菌抗生素。     

以叶片为外植体建立三倍体毛白杨高效再生体系

[目的]建立三倍体毛白杨叶芽再生体系与探索抗生素对叶片再生不定芽的影响。[方法]以叶片为外植体,探索适合三倍体毛白杨遗传转化的再生条件和抗生素对叶片再生不定芽的影响。[结果]结果表明,三倍体毛白杨最适合的不定芽分化培养基配方为MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.50 mg/L;在基因工程中,40 mg/L的卡那霉素为选择性抗生素使用浓度,300 mg/L的头孢霉素为抑菌性抗生素使用浓度;再生的不定芽在MS+IBA 0.10 mg/L固体培养基中生根率可达82%。[结论]该研究为毛白杨遗传转化中适宜的培养基成分和抗生素浓度的选择提供科学依据。     

优选盆栽小菊高效再生及转化体系的建立

为筛选最适盆栽小菊品种,建立再生转化体系,以11个盆栽小菊品种无菌苗叶片为外植体,比较不同植物生长调节剂配比和抗生素对叶片愈伤组织诱导、不定芽分化及生根等过程的影响。结果表明,11个品种中再生率最高的为微风深红,其最适分化培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,再生率为95.0%;叶片分化对卡那霉素和潮霉素的抗性选择压分别为15、10 mg/L;对植株生根的抗性选择压分别为10、8 mg/L;羧苄青霉素抑菌浓度最适范围为200～400 mg/L。本研究建立了盆栽小菊叶片外植体的高效再生及转化体系,为今后菊花的转基因工作奠定良好的基础。     

光皮桦叶片再生体系的建立

【目的】建立光皮桦叶片高效再生体系，为光皮桦的良种培育及遗传转化研究提供依据。【方法】以光皮桦无菌叶片为外殖体，分别用含0.6 mg/L TDZ 的MS、WPM和1/2MS培养基进行不定芽诱导分化，筛选最佳基本培养基；向筛选出的最佳基本培养基中添加0.05 mg/L NAA及不同质量浓度（0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/L）TDZ的激素组合组成不定芽分化培养基，用于诱导不定芽分化，筛选最佳不定芽诱导分化培养基；以1/2MS培养基为基本培养基，分别附加0，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 mg/L的IBA或0.5，1.0，2.0，3.0 mg/L的NAA组成生根培养基，用于再生苗生根，筛选最佳生根培养基，建立光皮桦叶片再生体系。【结果】光皮桦无菌叶片诱导不定芽的最适基本培养基为MS培养基，其诱导的不定芽最多，且芽生长状况良好，颜色深绿；最适不定芽诱导分化培养基为：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5.5 g/L，在该培养基上叶片丛生芽诱导率可达到80.00%，平均不定芽数高达12.00个，且芽生长健壮，呈深绿色；最适再生苗生根培养基为：1/2MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5.5 g/L，在该培养基上再生苗的生根率达100%，平均根数为14.5个，平均根长为11 cm，根较粗壮，基部无愈伤组织，且产生了很多毛细根。【结论】建立了光皮桦无菌苗叶片的高效再生体系。     

甜樱桃离体叶片再生的研究

利用甜樱桃的无菌苗叶片做外植体,进行离体叶片再生不定芽研究。结果表明:培养基中添加的激素浓度、种类和配比均影响不定芽再生,6-BA和NAA组合诱导甜樱桃离体叶片再生的活性较强;在MS 6-BA3mg/L NAA0.2mg/L GA30.5mg/L AgNO35.0-10.0mg/L培养基上,通过3次继代培养的不定梢的叶片,再生不定芽的频率达6.4%,确定良好的生根培养基为1/2MS IBA 0.7mg/L NAA0.2mg/L 蔗糖20g/L 琼脂7g/L,生根率可达75.1%。     

杂交构树叶片愈伤诱导及植株再生

以杂交构树试管苗叶片为外植体,探讨了不同植物生长调节剂组合、叶片着生部位、GA3浓度对杂交构树不定芽再生的影响,建立了叶片不定芽再生体系,为今后的遗传转化奠定了基础。结果表明:杂交构树叶片愈伤诱导和不定芽分化的最适培养基是MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L,愈伤诱导率为100%,不定芽再生率为91.7%;叶片培养最佳取材部位是自试管苗顶端向下伸展叶第l～3片叶;培养基添加0.5mg/LGA3,芽增殖系数高达8.22,芽有一定的伸长生长;附加低浓度的6-BA0.3mg/L,芽明显伸长,长为3.89cm,得到壮苗,可直接用于生根培养;生根培养添加NAA1.0mg/L,诱导生根的时间最短为9d,生根率最高,达86.7%。     

库尔勒香梨离体叶片再生体系的建立

【目的】建立库尔勒香梨叶片诱导再生的稳定高效再生体系。为梨的遗传转化研究奠定基础。【方法】以库尔勒香梨离体培养的继代30 d左右的无菌苗叶片为材料,1/2 MS为基本培养基,用TDZ与IBA或NAA分别组合设计配方,研究不同生长调节剂质量浓度组合对不定芽诱导过程中愈伤组织形成率和不定芽形成率的影响,选取最优配方附加不同质量浓度的AgNO_3,获得不定芽再生的最佳培养基。用IBA和NAA分别组合设计生根生长调节剂的配比,根据生根率、平均生根数以及平均生根长度筛选最适宜生根的生长调节剂的配比,建立生根的培养体系。【结果】库尔勒香梨叶片诱导不定芽再生的最佳培养基为1/2 MS+TDZ 1.0mg/L+IBA 0.5 mg/L+AgNO_3 0.5 mg/L,愈伤组织诱导率100%,不定芽形成率84.92%。最适宜香梨再生苗生根的培养配方为1/2 MS+0.5 mg/L IBA+0.9 mg/L NAA,结合前期暗培养7 d,生根率可达100%,平均生根条数为5.66,平均根长度为2.8 cm。【结论】建立了库尔勒香梨的再生体系。     

葡萄叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

本研究以优良无核葡萄品种莫利莎葡萄试管苗为试材，研究了卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）对葡萄继代苗生长和离体叶片再生的影响，以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度；同时研究了不同浓度的头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）对葡萄离体叶片再生的影响，以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。试验结果表明葡萄继代苗对Hyg的敏感性强于Kan，葡萄遗传转化更适合使用潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记。Hyg 3.0mg/L即达到继代苗致死浓度，可作为转化后抗性苗的筛选浓度，Hyg 0.8mg/L完全抑制叶片不定芽的分化，可作为叶盘法转化时抗性芽的选择压。葡萄叶盘法基因转化中抑制农杆菌生长的抗生素可选用Cef 300mg/L或Carb 400mg/L，但对不定芽的分化有抑制作用。     

中国野生毛葡萄叶盘法遗传转化中抗生素种类及体积质量分数的筛选

为获得毛葡萄遗传转化体系中合适的抗生素种类和体积质量分数,以毛葡萄单株“花溪-4”为试材,研究了选择抗生素潮霉素(Hygromycin,Hyg)、卡纳霉素(Kanamycin,Kan)和抑菌抗生素羧苄青霉素(Carbenicillin,Carb)及头孢霉素(Cefotaxime,Cef)对其离体叶片再生和再生芽成苗的影响.结果表明:0.1 mg/L的Hyg和10 mg/L的Kan可完全抑制不定芽再生,适合遗传转化中转基因再生芽筛选;再生芽在添加5 mg/L Hyg和40 mg/L Kan培养基中表现黄化致死,不能成苗,可用于转基因苗选择.300 mg/L的Cef或400 mg/L的Carb均可促进花溪-4不定芽再生,同时对根癌农杆菌抑制效果良好,适宜于毛葡萄遗传转化中抑制农杆菌生长.     

"美人指"葡萄离体叶片器官再生体系建立的研究

以“美人指”葡萄试管苗的叶片、叶柄为试验材料,研究了激素、光照、基本培养基等因素对不定芽再生的影响。结果表明:激素的种类以及质量浓度、光照、基本培养基对叶片不定芽的再生都起着重要的作用,叶片在25℃1、6 h/8 h光/暗周期条件下,以1/2 MS BA 1.9~2.1 mg/L NAA 0.01 mg/L诱导培养基培养20~30 d获得了不定芽,经伸长、生根培养,获得了正常的再生植株。     

杨树农杆菌介导遗传转化中抗生素浓度的筛选

研究头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢拉啶、头孢他啶4种头孢类抗生素对根癌农杆菌LBA4404和EHA105的抑制作用;以欧美杨111和盖杨组培苗为材料,研究卡那霉素（Km）对2种杨树叶片分化及茎段生根的影响,并分析头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化及茎段生根的影响。结果表明,头孢噻肟钠、头孢曲松钠和头孢他啶对LBA4404具有良好的抑菌效果,使用浓度为50 mg/L,其中头孢噻肟钠对农杆菌EHA105的抑菌效果最好,头孢拉啶抑菌效果较差。不同杨树品种对卡那霉素的耐受性差异不大,欧美杨111在叶片转化筛选培养时,使用浓度为10 mg/L,抗性芽生根阶段为20 mg/L;盖杨在叶片转化筛选培养时,卡那霉素使用浓度为20 mg/L,抗性芽生根阶段为25 mg/L,头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化和茎段生根影响不大。     

农杆菌介导的海岛棉茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

采用根癌农杆菌LBA4404和EHA105介导,对海岛棉的茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。茎尖培养与棉花体细胞胚胎发生相比,不同基因型的茎尖再生频率差异不明显;在9种不同的激素组合中,以6-BA0.5 mg/L NAA0.1 mg/L与1/2MSB5 IBA 0.1 mg/L对茎尖的再生效果较好;获得较高转化频率的海岛棉培养条件为:海岛苗茎尖在OD600值为0.6~0.8农杆菌菌液中感染20~30 min,共培养3 d后进行转接,在含有不同激素和抗生素的各类培养基中进行抑菌和筛选继代培养,选择压以50~150 mg/L梯度进行;农杆菌以EHA105菌株的转化效果较好;抗性苗用SDS-CTAB法提取其总DNA,进行PCR扩增检测,有7株PCR检测呈阳性反应。由此,初步证明外源抗虫基因已经进入到再生植株的细胞核中。     

不同抗生素对紫雨桦离体叶片愈伤组织诱导的影响

以紫雨桦无菌叶片为试材,研究头孢霉素、头孢曲松钠、羧苄青霉素和特美汀4种不同浓度的抑菌抗生素对紫雨桦离体叶片愈伤组织诱导的影响,分析4种抑菌抗生素对农杆菌 EHA105（pCHS）的抑菌效果。结果表明,抗生素是头孢霉素、头孢曲松钠、特美汀比羧苄青霉素抑菌效果好,其中头孢霉素和头孢曲松钠的适宜浓度范围为200～400 mg／L、特美汀为400～800 mg／L。30～40 mg／L的卡那霉素、15～20 mg／L的G418或潮霉素还可用于紫雨桦为受体的遗传转化中筛选转化体。     

将TERF1基因导入糖橙的研究

用携带TERF1基因的EHA105和LB4404 2种农杆菌分别转化糖橙实生苗节间茎段.根据已建立的再生体系和转化体系,对已得到的抗性芽经PCR和RT-PCR检测,验证已获得7个转TERF1基因的糖橙株系.此外,还比较了2种农杆菌菌株对糖橙的浸染能力,结果表明,EHA105农杆菌的浸染能力强于LB4404.     

抗生素对草莓内生菌的抑制

研究了几种常用抗生素对草莓章姬内生菌的抑制效果。结果表明:卡那霉素(Kanamycin)不仅对内生菌无抑制效果,而且对植株有毒害作用;头孢霉素(Cefotaxime)和羧苄青霉素(Carbenicillin)的抑菌效果不明显,但对试管苗生长有促进作用;青霉素G钠(PenicinllinGsodium)浓度为400mg/L时抑菌率可达100%,且对植株的生长有明显促进作用。     

抗生素对梨离体叶片不定芽再生的影响

以沙梨‘金花’和西洋梨‘丰产’两个品种的无菌苗幼叶为试材，研究了卡那霉素、头孢霉素和羧苄青霉素对梨离体叶片不定芽再生的影响。用新梢顶端1～3节新展开的叫‘片制备外植体，分别接种在NN69 BA5mg／L NAA0．3mg／L CH300mg／L的培养墓上，附加不同浓度的抗生素，黑暗处理20d，结果表明：500mg／L的浓度下，头孢霉素完全抑制供试品种叶片的再生；400mg／L的浓度下，羧苄青霉素完全抑制供试品种叶片的再生。丰产和金花对卡那霉素均敏感，5mg／L就极显著的抑制不定芽再生；10mg／L时不定芽不能正常生长，白化死亡，同浓度下供试品种不能分化不定根。     

抗生素对高粱愈伤组织诱导和生长的影响

用羧苄青霉素等抗生素进行抑菌试验,以羧苄青霉素和头孢霉素的抑菌效果较好.头孢霉素对高梁愈伤组织的毒性表现出比羧苄青霉素大.浓度低于500 mg/L羧苄青霉素对高梁愈伤组织的生长起促进作用;而分化率随着羧苄青霉素浓度的提高而下降.在农杆菌介导高梁遗传转化时,选用羧苄青霉素是合适的,浓度以250 mg/L为宜.高梁愈伤组织对潮霉素的反应比卡那霉素更敏感,高梁不同基因型愈伤组织对卡那霉素和潮霉素的反应在褐化(死亡)率上表现不同.在以潮霉素作为抗性筛选标记时,选择压以50～75 mg/L为宜.     

Meropenem as an Alternative Antibiotic Agent for Suppression of Agrobacterium in Genetic Transformation of Orchid

A case of Meropenem as a novel antibacterial agent to suppress and eliminate Agrobacterium tumefaciens in the Agrobacterium-mediated transformation of orchid protocorm-like bodies （PLBs） has been reported in this article. The in vitro activities of meropenem and four comparator antibacterial agents against three Agrobacterium tumefaciens strains, LBA4404, EHA101, and GV3101, were assessed. In addition, the effect of meropenem on the growth of Dendrobium phalaenopsis PLBs was determined. Compared with other commonly used antibiotics （including ampicillin, carbenicillin, cefotaxime, and cefoperazone）, meropenem showed the highest activity in suppressing all tested A. tumefaciens strains （minimum inhibitory concentration [MIC] 〈 0.5 mg L^-1, which is equal to minimum bactericidal concentration [MBC]）. Meropenem, at all tested concentrations, except for 10 mg L^-1 concentration, had little negative effect on the growth of orchid tissues. The A. tumefaciens strain EHA101 in genetic transformation with vector plG121Hm in infected PLBs of the orchid was visually undetectable after a two-month subculture in 1/2 MS medium with 50 mg L^-1 meropenem and 25 mg L^-1 hygromacin. The expression and incorporation of the transgenes were confirmed by GUS histochemical assay and PCR analysis. Meropenem may be an alternative antibiotic for the effective suppression of A. tumefaciens in genetic transformation.