基于RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用

【目的】百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum L?ve,2n=2x=14,JJ或EbEb)是小麦改良的重要亲缘物种,开发染色体特异分子标记对于加快其有利基因向小麦中的转移和应用有重要意义。【方法】利用百萨偃麦草分蘖期叶片RNA-seq获得的EST序列与节节麦D基因组序列进行比对,鉴定出4 957条没有相似性的序列作为筛选百萨偃麦草特异序列的基础序列。从这些基础序列中随机选择部分序列设计EST-PCR引物507对,通过在普通小麦中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中的扩增分析,筛选出百萨偃麦草基因组特异标记,然后在已经选育出的8个小麦-百萨偃麦草异染色体系中进行染色体定位,并探讨这些标记在小麦染色体工程中的应用潜力;根据谷类作物的共线性,以百萨偃麦草EST序列设计共线性引物100对,并比较这些引物的扩增和定位结果。【结果】在开发的507对引物中,204对(40.2%)在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中具有特异扩增,多态率远高于利用小麦(12%)和百萨偃麦草(14%)EST设计的234对共线性引物产生的多态率,建立了高效开发小麦亲缘物种特异标记的新方法;利用8个中国春-百萨偃麦草异染色体系,共定位了198个百萨偃麦草特异标记,分别位于染色体1J(31)、2JS(15)、2JL(26)、3JS(20)、4JS(12)、4JL(12)、5J(27)、6JS(13)、6JL(22)和7JS(20),其中189个是根据百萨偃麦草转录组序列设计;利用定位于1J和6J的特异标记确定了4个易位系的染色体身份,其中1个涉及1J的大片段易位,2个涉及6JS的不同区段易位,1个为小片段中间插入易位;利用这些易位系,将30个1J和12个6J特异标记分别定位于2个物理区段。【结论】通过RNA-seq结合与小麦基因组序列比对可以获得小麦亲缘物种相对特异的EST序列并据此开发引物,建立了开发外源染色体特异标记的新方法,开发的标记可应用于小麦异易位系鉴定和缺失物理图谱的绘制。     

盐胁迫对中国春-百萨燕麦草双二倍体SOD、CAT活性和MDA含量的影响

利用不同浓度的NaCl溶液对中国春一百萨偃麦草双二倍体进行盐胁迫处理,测定不同盐浓度下中国春-百萨偃麦草双二倍体叶片中SOD、CAT两种保护酶的活性及MDA的含量变化.在盐胁迫下中国春-百萨偃麦草双二倍体SOD活性随着盐浓度升高出现三个升降过程.在盐浓度高于300mmol/L的处理时,中国春-百萨偃麦草双二倍体SOD活性均高于对照中国春;盐胁迫下中国春和中国春-百萨偃麦草双二倍体CAT活性均出现先升高后降低趋势.在盐浓度高于300mmol/L的处理时,中国春-百萨偃麦草双二倍体CAT活性均高于对照中国春,且两者的CAT活性均存在下降趋势.中国春-百萨偃麦草双二倍体的CAT活性总的下降幅度明显低于中国春;随着盐胁迫浓度的增加,中国春膜脂化产物MDA含量逐渐升高,而中国春-百萨偃麦草双二倍体MDA含量变化不大,总体维持5.59±0.98umol/L.在盐浓度高于300mmol/L处理时,中国春MDA含量显著高于双二倍体.结果表明:中国春-百萨偃麦草双二倍体在较高盐浓度处理下,表现出较强的抗氧化酶活性,活性氧清除能力增加;质膜伤害程度保持相对稳定,以较低的水平积累MDA.中国春-百萨偃麦草双二倍体具有较好的耐盐性,可作为小麦抗盐育种的种质资源.     

普通小麦-长穗偃麦草异附加系的分子标记鉴定

利用分布于小麦7个部分同源群的1 246对引物对15个可能的小麦-长穗偃麦草二体异附加系的4个亲本的基因组DNA进行扩增。结果表明,186对SSR、209对EST-SSR和22对STS引物能够在长穗偃麦草中扩增出不同于其他3个小麦亲本的特异条带,其中18对引物可以在14个附加系中的1~7个附加系扩增出长穗偃麦草的特异带,说明它们可能添加长穗偃麦草的遗传物质。5个附加系(1-3、1-8、1-27、2-6和2-22)可能含有长穗偃麦草第7同源群染色体,4个附加系(5-10、5-20、6-23和6-18)可能含有长穗偃麦草第6同源群染色体。附加系1-13可能附加2条不同同源群的长穗偃麦草染色体。同时发现,小麦与长穗偃麦草杂交及其后代衍生过程中长穗偃麦草染色体间可能发生遗传重组。     

普通小麦-百萨偃麦草染色体易位的选育与鉴定

 利用染色体C 分带、基因组原位杂交和花粉母细胞减数分裂分析的方法 ,从普通小麦中国春与中国春 百萨偃麦草双倍体回交BC1F5 代中选育出 5份纯合易位新种质 ,分别为 :含 1对易位染色体并添加 1对百萨偃麦草完整染色体的Tj0 1和Tj0 2 ;添加 1对易位染色体的Tj0 3 ;含 1对易位染色体并添加 1对百萨偃麦草某一染色体臂端着丝粒染色体的Tj0 4和含 1对易位染色体并添加 2对百萨偃麦草完整染色体的Tj0 5。这些易位染色体的易位断点均不在着丝粒处 ,能稳定传递 ,且所涉及的植株生长和结实均正常。推测在该回交后代中小麦与百萨偃麦草染色体之间发生了自发的部分同源重组 ,这将有利于百萨偃麦草优异基因向普通小麦的转移与利用     

盐胁迫对中国春-百萨燕麦草双二倍体SOD、CAT活性和IMDA含量的影响

利用不同浓度的NaCl溶液对中国春-百萨偃麦草双二倍体进行盐胁迫处理，测定不同盐浓度下中国春-百萨偃麦草双二倍体叶片中SOD、CAT两种保护酶的活性及MDA的含量变化。在盐胁迫下中国春-百萨偃麦草双二倍体SOD活性随着盐浓度升高出现三个升降过程。在盐浓度高于300mmol／L的处理时，中国春-百萨偃麦草双二倍体SOD活性均高于对照中国春；盐胁迫下中国春和中国春-百萨偃麦草双二倍体CAT活性均出现先升高后降低趋势。在盐浓度高于300mm01／L的处理时，中国春-百萨偃麦草双二倍体CAT活性均高于对照中国春，且两者的CAT活性均存在下降趋势。中国春-百萨偃麦草双二倍体的CAT活性总的下降幅度明显低于中国春；随着盐胁迫浓度的增加，中国春膜脂化产物MDA含量逐渐升高，而中国春-百萨偃麦草双二倍体MDA含量变化不大，总体维持5．59±0．98umol／L。在盐浓度高于300mmol/L处理时，中国春MDA含量显著高于双二倍体。结果表明：中国春-百萨偃麦草双二倍体在较高盐浓度处理下，表现出较强的抗氧化酶活性，活性氧清除能力增加；质膜伤害程度保持相对稳定，以较低的水平积累MDA。中国春-百萨偃麦草双二倍体具有较好的耐盐性，可作为小麦抗盐育种的种质资源。     

45SrDNA在百萨偃麦草染色体上的分布

百萨偃麦草是小麦亲缘物种之一,对环境胁迫和生物胁迫具有很强的抗性,是小麦遗传改良的重要资源。为了对导入的百萨偃麦草染色体及片段进行有效鉴定,创造新种质。利用顺序分子原位杂交方法,研究了45SrDNA在百萨偃麦草染色体上的分布情况。结果发现45SrDNA在百萨偃麦草上有1对主位点,但在百萨偃麦草1J染色体上没有观察到45SrDNA位点的存在。     

百萨偃麦草在小麦遗传改良中的应用研究进展

百萨偃麦草是小麦亲缘物种之一,对环境胁迫和生物胁迫具有很强的抗性,是小麦遗传改良的重要资源.结合南京农业大学多年来的研究进展,对百萨偃草麦抗性基因向小麦中的转移与利用、百萨偃草走基因组与染色体分析等现状进行了系统总结,并对如何更好地研究和利用百萨偃草麦有益基因提出了展望.     

简单重复序列(AAG)_5在百萨偃麦草染色体上的分布

百萨偃麦草是小麦亲缘物种之一,对环境胁迫和生物胁迫具有很强的抗性,是小麦遗传改良的重要资源。为了对导入的外源染色体及片段进行有效鉴定,利用荧光原位杂交方法,研究了合成的简单重复序列(AAG)5在百萨偃麦草染色体上的分布情况。结果表明,(AAG)5在百萨偃麦草上有多个位点,利用(AAG)5作探针可以将百萨偃麦草的各条染色体区分开来。     

偃麦草E染色体组特异RAPD和SCAR标记的建立

用100条10碱基随机引物，以普通小麦中国春，中间偃麦草为材料进行RAPD分析，筛选到一个偃麦草染色体组特异引物OPF03，并从中间偃麦草中克隆了该引物的特异DNA片段OPF031291。将该片断与比萨偃麦草中的OPF031296（GenBank序号U43516）比较，同源性为88％。根据OPF031291的序列，设计了2对SCAR引物，利用OPF03和引物P3，P4对普通小麦，普通小麦－中间偃麦草的部分双二倍体，长穗偃麦草，中间偃麦草，小麦－二倍体长穗偃麦草代换系，附加系共6类材料进行了RAPD和SCAR分析，发现RAP标记OPR031291没有出现在含E^e染色体组的材料中，而标记SCAR982则出现于所有含E染色体组的材料中。说明，根据E^b染色体组特异RAPD标记转化的SCAR标记，可以同时检测小麦背景下的E^e染色体。     

小麦-长穗偃麦草渗入系HMW-GS组成及等位变异分析

长穗偃麦草(Agropyron elongatum)是小麦品质遗传改良的重要基因资源。为明确98份具有优异抗病性的小麦-长穗偃麦草渗入系中的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)类型,利用SDS-PAGE法对其进行了调查。结果表明,共有13种等位基因变异,其中,Glu-A1位点上有1,2*和N型,N型亚基出现频率最高,为57.14%;Glu-B1位点上发现了6种等位变异,优质亚基14+15,7+8,13+16和17+18出现频率达到45.92%;Glu-D1位点上发现4种等位变异,出现频率最高的为2+12型,优质亚基5+10型达到20.41%。在22种亚基组合中,N,9+7,2+12组合出现的频率最高,为28.57%。品质为8~10分的材料有31份,频率达到31.5%。由此可见,在小麦-长穗偃麦草渗入系中存在丰富的高分子量谷蛋白亚基变异和优质组合,这为选育优质抗病的小麦品种提供了种质资源与依据。     

二倍体长穗偃麦草E组染色体研究进展

二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum)E组染色体是组成偃麦草属(Thinopyrum)多倍体物种的基本染色体组,携带有对小麦遗传育种有益的基因,人们已从多方面解读了E组染色体与小麦及其他近缘种属的遗传进化关系。综述了二倍体长穗偃麦草E组染色体与比萨偃麦草和小麦的亲缘关系、生化标记、分子标记和高分子量谷蛋白研究的进展。     

小麦新品系高分子量麦谷蛋白亚基的组成研究

采用SDS-PAGE电泳方法鉴定和分析了199个春小麦高代品系的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成与分布。结果表明,在Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三个位点上共检测到10种不同的高分子量谷蛋白亚基及21种亚基组合类型,优质亚基5+10占的比例较高(60.30%),但含2*、7+8、5+10,1、7+8、5+10和1、17+18、5+10等优质亚基组合的比例较低(16.58%)。按照Payne等人的评分方法进行了评分,199个春小麦高代品系的高分子量麦谷蛋白亚基Glu-1评分在3~10,平均为7.38分。     

六倍体普通小麦高分子量谷蛋白亚基Glu-A1和Glu-B1共同缺失材料研究初报

利用SDS-PAGE方法对源于CIMMYT的六倍体普通小麦材料SYN351进行了高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)分析,结果表明SYN351Glu-A1和Glu-B1位点编码的HMW-GS同时全部缺失,唯有Glu-D1位点编码的HMW-GS(5 10)存在(N,N,5 10),是六倍体普通小麦中一种高分子量谷蛋白亚基缺失的新类型。     

高分子量麦谷蛋白亚基基因1Bx14转化小麦

 【目的】利用基因枪将优质高分子量麦谷蛋白亚基基因1Bx14导入普通小麦栽培品种绵阳19，为利用优质基因进行小麦品质改良奠定基础。【方法】构建小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因1Bx14的胚乳特异性植物表达载体，利用基因枪将其转入不含该亚基的小麦品种绵阳19幼胚愈伤组织中，经潮霉素抗性筛选、PCR检测后，阳性植株进行PCR-Southern和Southern杂交验证，利用SDS-PAGE分析目的基因在转基因后代籽粒中的表达。【结果】从转化的652块愈伤组织中共获得6株转基因阳性植株，转化效率0.92% 。转化后代种子分析表明，1Bx14在部分转基因后代种子中表达，但同时也导致部分内源高分子量麦谷蛋白亚基基因不同程度的沉默。【结论】本研究成功地将小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Bx14导入普通小麦绵阳19中，并在部分后代种子中得到了表达。     

小麦高分子量谷蛋白亚基的遗传特性研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法,在蛋白质水平上对多个亲本及其杂交获得的正反交F1代杂交籽粒进行小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)分析,研究其遗传规律.结果表明:小麦高分子量谷蛋白亚基具有品种特性,表达受遗传控制,不受环境影响;小麦高分子量谷蛋白业基在F1代有些组合呈共显性,有些组合呈倾母性的遗传特性.     

节燕98-1 98-2 98-3的高分子量谷蛋白亚基的比较研究

采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,对同一远缘组合分离出来的3个类型分别入选45,11,9个遗传性基本稳定且具有高产、多抗的小麦株系的高分子量谷蛋白亚基进行了分析。结果表明,在SDS-PAGE电泳分析中,出现了16种不同的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)及23种亚基组合类型,优质亚基及亚基组合所占的比例较少,65个株系的总体品质评分偏低,其变幅为3～9分,平均为6．07分。但在所分析的材料中,出现了一些少见的特殊亚基：6^*,6^* 8^*,5 12,2 10 12,5 10 2 12。研究了这些HMW-GS的组合频率及特点。65个株系中9个具有5 10优质亚基、6个具有2^*亚基和12个具有7 8亚基,它们可供小麦优质育种利用。研究表明,通过远缘杂交能够选育出具有高产、抗病和优质的小麦新材料。     

澳大利亚小麦品种高分子量谷蛋白亚基组成分析(英文)

[目的]给我国小麦品质育种提供有益的信息。[方法]利用SDS-PAGE技术对澳大利亚64份主要推广小麦品种的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成进行研究,明确其HMW-GS构成,从中筛选出具有优质亚基的材料。[结果]在参试材料中共检测到9种不同的亚基类型。在Glu-A1位点有Null、1等位变异类型,以1为主要类型,频率为59.37%;Glu-B1有7、7 +8、7 +9、14 +15、17 +18 5个等位变异类型,以7 +8为主要类型,频率为56.20%;Glu-D1有2 +12、5 +10等位变异类型,以2 +12为主要类型,频率为70.30%。同时发现共有12种亚基组合,以"1,7 +8, 2 +12"为主要类型。所有品种品质得分范围为4 ~10,平均得分为7.4。[结论]64个供试品种品质普遍较好。     

澳大利亚小麦品种高分子量谷蛋白亚基组成分析

[目的]为我国小麦品质育种提供有益的信息。[方法]利用SDS-PAGE技术对澳大利亚64份主要推广小麦品种的高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）组成进行研究,明确其HMW-GS构成,从中筛选出具有优质亚基的材料。[结果]在参试材料中共检测到9种不同的亚基类型。在Glu-A1位点有Null、1等位变异类型,以1为主要类型,频率为59.37%;Glu-B1有7、7＋8、7＋9、14＋15、17＋185个等位变异类型,以7＋8为主要类型,频率为56.20%;Glu-D1有2＋12、5＋10等位变异类型,以2＋12为主要类型,频率为70.30%。同时发现共有12种亚基组合,以＂1,7＋8,2＋12＂为主要类型。所有品种品质得分范围为4～10,平均得分为7.4。[结论]64个供试品种品质普遍较好。     

小麦高分子量谷蛋白亚基的遗传特性研究*

 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法，在蛋白质水平上对多个亲本及其杂交获得的正反交F₁代杂交籽粒进行小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)分析，研究其遗传规律。结果表明：小麦高分子量谷蛋白亚基具有品种特性，表达受遗传控制, 不受环境影响；小麦高分子量谷蛋白亚基在F₁代有些组合呈共显性，有些组合呈倾母性的遗传特性。     

我国部分优质小麦高分子量谷蛋白亚基组成分析

利用SDS-PAGE方法对我国49份优质小麦的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)进行了分析,共检测到13种亚基和16种亚基组合。结果表明:高分子量谷蛋白(Glu)变异较为丰富,Glu-A1位点有3个等位变异类型,Glu-B1有6个等位变异类型,Glu-D1有4个等位变异类型,而且还发现一些稀有亚基13 16。优质亚基5 10、2~*亚基在供试品种中的比例较高。供试品种HMW-GS品质得分为5～10分,平均为8.04分,表明在我国小麦育种中已注重加强优质谷蛋白亲本材料的引进和利用。