虎杖愈伤组织的诱导及其白藜芦醇形成初探

将虎杖Polygonum cuspidatum不同外植体经不同消毒时间处理后，接种在添加不同激素种类和水平的相同基本培养基上或相同激素种类和水平基本培养基上进行诱导实验，同时对根和根茎芽、叶、韧皮诱导的愈伤组织进行白藜芦醇含量的测定，结果表明，基本培养基以MS较好，外植体叶对激素种类较为敏感，其中适当浓度的NAA诱导愈伤组织比2，4-D的效果好，KT比BA好，添加KT的培养基上诱导愈伤组织比较紧密，有利于分化，在MS＋NAA2mg／L＋KT0．1mg／L培养基上诱导愈伤组织较好，根茎芽的诱导率最高，为73％；愈伤组织的生长趋势从接种的第3天开始生长，到21d时生长达到最高峰，干质量为0．4612g，以后生长速度减慢，对不同材料诱导的愈伤组织进行白藜芦醇含量的测定，其中根茎部芽的诱导的愈伤组织中白藜芦醇含量最高，其次是叶和根，最低的为韧皮。     

高效液相色谱法测定虎杖中的白藜芦醇含量

[目的]以乙醇为萃取剂,优化提取条件,建立高效液相色谱测定虎杖中的白藜芦醇的方法。[方法]色谱柱为phenomenex C18（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为无水甲醇-（浓度0.25%）乙酸（65∶35,V/V）等梯度洗脱,流速为0.8 ml/min,检测波长306 nm,以白藜芦醇的提取得率为评价指标,采用单因素试验和L25（5^4）正交试验法筛选最佳工艺条件。[结果]提取白藜芦醇的最佳工艺为：乙醇浓度为60%,料液比为1∶30（g/ml）,萃取温度为55℃,萃取时间为15 min;在此条件下,提取的白藜芦醇的提取得率达到0.826μg/g。[结论]该方法简便、快捷、准确性高,适用于虎杖中的白藜芦醇的测定。     

虎杖中白藜芦醇苷不同检测方法的比较

[目的]分析比较不同方法测定的人工栽培虎杖中白藜芦醇苷的含量差异。[方法]采用高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(CE)对人工栽培虎杖中白藜芦醇苷进行测定,并对这2种方法的线性范围、定量重现性、最低检测限及分离分析时间进行比较研究。[结果]选定HPLC-FD为测虎杖中白藜芦醇苷的最佳检测方法。检测条件:色谱柱为Diamonsil-C18(250 mm×0.46 mm,5μm),激发波长为334 nm,发射波长为408 nm,流动相为浓度25%乙腈,流速为1.0 ml/min,柱温为25℃,进样量为10μl。[结论]高效液相色谱法是测定虎杖中白藜芦醇苷含量较理想的方法。     

何首乌叶愈伤组织的诱导和二苯乙烯苷含量的检测

[目的]对何首乌叶进行愈伤组织诱导并检测叶愈伤组织中二苯乙烯苷的含量。[方法]在25℃暗箱培养条件下,将何首乌叶在含有浓度为1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和浓度为0.4 mg/L萘乙酸（NAA）的MS诱导培养基中进行诱导,15 d后把诱导出的愈伤组织转接到相同培养基中培养15 d,共转接3次,并通过HPLC法检测叶愈伤组织中二苯乙烯苷的含量。[结果]诱导出的愈伤组织生长状况良好,并且测得叶愈伤组织中二苯乙烯苷的含量为0.37 mg/g。[结论]由叶诱导出的愈伤组织中含有二苯乙烯苷,该愈伤组织可以用于进一步的生理生化研究。     

HPLC同时测定虎杖多个指标成分的含量

[目的]建立测定虎杖中多种特征成分含量的分析方法,对不同产地的虎杖药材进行品质评价。[方法]建立HPLC色谱法,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(C18柱250 mm×4.6 mm,5μm);以乙腈-浓度1%磷酸水溶液按以下梯度洗脱,0～30 min,乙腈20%～38%;30～70 min,乙腈38%～100%;流速为1.0 ml/min;检测波长为284 nm。[结果]白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚对照品浓度在一定的范围内与峰面积呈良好线性关系,平均回收率在95.00%～105.00%(n=5)。[结论]该方法操作简便,结果准确可靠,可同时测定中药虎杖类蒽醌及中芪类成分的含量,为虎杖药材的品质评价提供一种简易、可行、特征性强的分析方法。     

超声波辅助提取虎杖中的白藜芦醇的工艺研究

[目的]优选超声波辅助提取虎杖中白藜芦醇的最佳工艺。[方法]采用超声波提取,通过正交试验考察提取时间、提取温度、超声功率对虎杖中白藜芦醇提取率的影响。[结果]虎杖中提取白藜芦醇的最佳工艺为：以无水乙醇为提取剂,超声波的提取温度为80℃,提取时间为45 min,提取功率为200 W。在此条件下,虎杖中白藜芦醇的提取率可以达到0.940%。[结论]用超声波辅助提取虎杖中的白藜芦醇,工艺稳定性好且简便易行,为有效提取白藜芦醇提供了一种安全可靠的方法。     

葡萄松散型愈伤组织的培养及其白藜芦醇含量的测定

【目的】获得葡萄(Vitisvini fera L.)松散型愈伤组织,并了解其白藜芦醇含量的变化。【方法】以葡萄的叶、叶柄和茎分别作为外植体,在不同激素组合(6-卞氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、吲哚丁酸(IBA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D))的培养基(以B5培养基为基本培养基,含30g/L蔗糖和6g/L琼脂)上,进行愈伤组织的诱导和继代培养,并利用高效液相色谱法(HPLC)对不同来源愈伤组织中的白藜芦醇含量进行测定。【结果】以葡萄叶为外植体时,诱导的愈伤组织出愈率很低;以叶柄和茎为外植体时,愈伤组织的出愈率均较高。利用叶柄和茎获得松散愈伤组织时,其诱导培养基组成分别是:B5培养基+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L和B5培养基+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L,其继代培养基均为B5培养基+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.1mg/L。在诱导培养基产生的愈伤组织中,白藜芦醇含量由高到低的顺序为叶柄>叶>茎。以叶、叶柄和茎为外植体诱导愈伤组织时,其白藜芦醇含量最高的培养基分别为B5培养基+6-BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L、B5培养基+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L和B5培养基+6-BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L。【结论】葡萄叶柄和茎易被诱导产生松散的愈伤组织,且经多次继代可以用于建立悬浮培养体系;葡萄愈伤组织中的白藜芦醇含量随外植体及培养基组成的不同而有所差异。     

盾叶薯蓣愈伤组织诱导研究

以试管培养的盾叶薯蓣为材料,研究了基因型、外植体种类、光暗培养条件、激素配比等因子对其愈伤组织诱导的影响。结果表明：不同基因型盾叶薯蓣的愈伤组织诱导率有较大差异;同一基因型,4种外植体(微块茎、幼芽、叶片、胚)的愈伤组织诱导率有所不同,胚和微块茎易诱导出愈伤,幼芽居中,而叶片较难,光暗培养条件下不同外植体的愈伤组织诱导率有差异,暗培养对叶片愈伤诱导有利,而光培养有利于微块茎愈伤组织的形成;2,4-D可以诱导微块茎、幼芽、胚形成愈伤,但6-BA和2,4-D的组合可以显著提高愈伤组织诱导率。叶片愈伤组织的诱导需要添加NAA和6-BA。     

DPI对尾叶桉愈伤组织诱导和抗氧化酶活性的影响

将不同浓度DPI添加到尾叶桉(Eucalyptus urophylla)愈伤组织诱导培养基中,分析DPI对其愈伤组织诱导和SOD、POD、CAT、APX 4种抗氧化酶活性的影响。结果表明,高于1.5μmol/L的DPI显著抑制尾叶桉愈伤组织的诱导,0~0.25μmol/L的DPI能减轻褐化,0.1μmol/L DPI抗褐化效果最好,褐化率仅9.82%。0~0.25μmol/L的DPI处理后,尾叶桉APX活性随DPI浓度升高而升高,SOD、POD、CAT活性随DPI浓度升高呈先升高后降低的趋势。添加0.10μmol/L DPI可提高保护酶活性,减轻褐化,促进尾叶桉愈伤组织诱导。     

生长调节剂对毛白杨叶愈伤组织诱导和植株再生的影响

利用ＮＡＡ，２，４－Ｄ，ＩＡＡ，ＩＢＡ，６－ＢＡ５种生长调节剂的不同浓度和不同组合配比，完成了对毛白杨叶愈伤组织诱导和守速植株的再生。在６－ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ分别和ＮＡＡ０．２－２．０ｍｇ／Ｌ、２，４－Ｄ２．０ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ２．０ｍｇ／Ｌ共同作用下，叶愈伤组织诱导率均能达到１００％时，愈伤组织在６－ＢＡ１．０ｍｇ‘Ｌ和ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ的作用下芽诱导率为８５％，而适当浓度的ＮＡＡ和ＩＢＡ有促进     

虎杖中白藜芦醇提取分离工艺的研究

利用单因素和正交试验对虎杖中白藜芦醇的提取条件 ,即乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度及次数进行了优化 ;同时 ,比较了大孔吸附树脂吸附法与有机溶剂萃取法富集分离提取液中白藜芦醇的效果。结果表明 :以料液比 1∶2 0 ,加入浓度 80 %的乙醇 ,在 60℃下提取 5h为最佳提取条件 ;采用大孔吸附树脂吸附法富集分离白藜芦醇 ,产品收率和纯度均高于常用的有机溶剂萃取法。     

虎杖中白藜芦醇的吸附特性和稳定性研究

[目的]研究用大孔树脂吸附分离虎杖中白藜芦醇的特性及其稳定性。[方法]分析大孔树脂对白藜芦醇的吸附曲线,分析流速、乙醇体积分数、提取时间、提取温度、pH等因素对大孔树脂吸附白藜芦醇的影响。[结果]AB-8树脂对虎杖中白藜芦醇的吸附更接近单分子层吸附。以1.5 m L/min流速通过层析柱时吸附率更高,用70%乙醇提取虎杖中白藜芦醇时提取率最高,3 h是最佳提取时间;60℃是最佳提取温度;p H为4时白藜芦醇提取率最高。稳定性研究表明,白藜芦醇在酸性条件下保存浓度基本不变。[结论]用大孔树脂吸附分离白藜芦醇具有一定的优势。     

苹果叶片愈伤组织的诱导培养

为获得优质的愈伤组织,以国光和富士苹果的幼嫩叶片为外植体,研究了不同的消毒方法、植物生长调节剂种类及其浓度、光照条件、叶片放置方式等因素对叶片愈伤组织诱导的影响。结果表明:(1)直接进行光培养,愈伤诱导率只有50%～55%,先暗培养14 d再光培养与先暗培养21 d再光培养叶片的愈伤组织诱导率都达100%,但前者产生的愈伤组织结构紧密呈淡黄色,后者出现白化疏松的愈伤细胞。暗培养14d为诱导叶片愈伤组织形成的有利条件。(2)未添加激素的MS基本培养基比添加激素的MS培养基有利于降低叶片的褐变率。(3)采用叶片远轴面接触培养基比近轴面接触培养基的愈伤诱导率高约25%～30%,且诱导愈伤组织形成的时间较早。(4)国光叶片在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基中,富士叶片在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基中愈伤组织的诱导效果最佳。     

汾阳核桃叶片愈伤组织的诱导、增殖及分化培养

试验中采取汾阳核桃一年生实生苗作为外植体材料,其中叶片愈伤组织的诱导、增殖及分化的基本培养基均为改良DKW。试验结果显示:诱导核桃叶片形成愈伤组织的最佳激素配比为:6-BA0.01mg/L 2,4-D0.01mg/L;促使核桃愈伤组织增殖的最佳激素配比为:BA0.01mg/L 2,4-D0.8mg/L;诱导核桃愈伤组织芽分化的最佳激素配比为:KT0.8mg/L NAA0.4mg/L。     

白木香愈伤组织与叶片DNA快速提取方法的确定

[目的]确定白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法.[方法]用TE、ES1、ES2 3种提取液及相应的方法提取叶片和愈伤组织总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测提取产物,通过普通PCR及荧光定量PCR检查DNA的可用性,并将PCR产物经克隆测序验证.[结果] ES1法提取的叶片和愈伤DNA条带清晰,纯度较高;普通PCR和荧光定量PCR可扩增出200和600bp左右的目的条带.ES2法提取液电泳不能检测到DNA条带,但PCR可扩增出愈伤组织200bp左右目的条带.TE法得到的提取液检测不到DNA条带且PCR不能得到目的条带.[结论] ES1提取液及相应的提取方法可用于白木香愈伤和叶片DNA高通量快速提取,为沉香属植物种质研究和分子研究奠定基础.     

雪莲果叶片愈伤组织的诱导

[目的]研究雪莲果叶片愈伤组织诱导的最佳灭菌方法和最佳培养基。[方法]以雪莲果叶片为外植体,用浓度0.1%升汞浸泡不同时间,筛选最佳灭菌方法;以MS为基本培养基,比较不同浓度生长调节物质对愈伤组织诱导的影响。[结果]用浓度0.1%升汞溶液灭菌8 min,外植体污染率为54.55%,死亡率为3.64%;最佳诱导培养基为MS+6-BA 1.0~1.5 mg/L+NAA 0.5~1.0 mg/L。[结论]最佳灭菌方法为浓度0.1%升汞对叶片灭菌8 min;诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA 1.0~1.5 mg/L+NAA 0.5~1.0 mg/L。     

青钱柳愈伤组织诱导

为获得优质的愈伤组织,以青钱柳嫩茎和叶片作为外植体诱导愈伤组织,研究了不同的消毒方法、基本培养基和植物生长调节剂对青钱柳叶片和茎段愈伤组织诱导的影响.结果表明,以青钱柳茎段为外植体诱导愈伤组织,最佳的消毒组合为70％酒精10 s+0.1％升汞4min,污染和死亡率最低(18.0％),诱导率最高(95.0％).以青钱柳叶...     

虎杖白藜芦醇超临界CO2萃取研究

采用超临界CO2流体技术对虎杖中自藜芦醇进行萃取，获得了初步萃取条件；萃取釜压力25MPa，温度50℃；解析釜压力5．7MPa，温度46℃，用无水乙醇及CY(自制)作为改性剂，同时用HPIC对萃取物进行白藜芦醇含量测定，可知CY作为改性剂效果最佳。     

川贝母叶高效诱导愈伤组织体系的研究

以川贝母的叶为外植体快速诱导愈伤组织,生产出大量有效组分含量高的组织培养物,为提高川贝母植物资源利用率奠定基础。通过比较川贝母叶的不同叶龄、形态部位、接种方式和培养温度对其愈伤组织产生的影响,获得川贝母愈伤组织诱导的最佳条件。结果得出,选取生长7 d左右的叶的形态学下端为外植体,采用叶基部直接插入培养基的接种方式,在变温的条件下培养,愈伤组织的诱导率最高,为95.20%。     

软籽石榴离体叶片愈伤组织诱导条件的优化

[目的]研究软籽石榴离体叶片愈伤组织诱导的最佳条件。[方法]以软籽石榴的幼嫩叶片为外植体,以MS为基本培养基,研究了不同浓度和类型的植物生长调节剂、叶片的不同部分、不同糖浓度和类型对愈伤组织诱导的影响。[结果]培养基MS＋0.1 mg/LNAA＋0.1 mg/L IBA＋1.0 mg/L 6-BA＋30 g/L蔗糖对愈伤组织的诱导效果最好,选择叶片中部或叶片基部为外植体,可以有效提高诱导率,降低褐化率,诱导率最高达93.3%,褐化率最低达23.3%。[结论]为石榴的离体快繁、种质保存和利用基因工程技术改良品质奠定一定的理论和实践基础。