应用 RT-PCR 法快速检测马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染ＰＬＲＶ的马铃薯病叶组织中提取出病毒的ＲＮＡ,进行ｃＤＮＡ合成及ＰＣＲ扩增,得到一条长度约６２０ｂｐ的特异ＰＣＲ扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的ＰＬＲＶ检测的新方法,其灵敏度要比ＰＬＲＶ的血清学检测方法高１０＾４倍,在基因水平上为ＰＬＲＶ的检测提供了更新手段,并在农业部植物检疫实验所马铃薯病毒检     

牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒双重RT-PCR方法的建立

参照GenBank上已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪瘟病毒(CSFV)的全基因序列,针对瘟病毒高度保守的5'-UTR设计3条引物,特异性扩增BVDV、CSFV.经过条件优化后,建立了快速鉴别BVDV和CSFV的双重RT-PCR诊断方法,扩增两种病毒的片段,大小分别为260、200 bp.试验证明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,利用双重RT-PCR对临床上60份疑似病料进行检测,双重PCR检测的结果与单重PCR检测结果总体符合率为100％,可用于临床病料检测,为防止猪瘟细胞苗的污染及进行CSFV和BVDV的鉴别诊断提供了有效方法.     

一步法RT-PCR快速检测猪瘟病毒

对猪瘟病毒(CSFV)5'端非编码区保守序列设计了一对引物,建立了检测CSFV一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对5株CSFV扩增结果均为阳性,对对照毒株扩增结果均为阴性;对CSFV检测的灵敏性为1.09×10-1ng总RNA量。以上结果表明该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

RT-PCR检测菊花B病毒的研究

根据菊花B病毒（CVB）的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织5和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,结果从感病组织中扩增出与预期的776bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将PCR产物插入pGEM-T载体克隆并测序,序列分析表明与CVB的相应序列同源性达到85％;将感病组织总RNA以10x梯度稀释成不同浓度,测出RT－PCR检测CVB的灵敏度为10^-4x;PCR产物克隆作为RT－PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,从而建立了CVB快速、灵敏、准确的RT－PCR鉴定和检测技术。     

RT-PCR技术检测猪瘟病毒应用浅析

本文介绍RT-PCR技术的应用和操作方法,通过试验验证了RT-PCR的应用优势,使用RT-PCR技术可有效提高检测效率,提高检测准确率,让猪瘟病毒得到及时发现,及早隔离病猪.     

RT-PCR技术检测河南省猪瘟病毒的研究

对25个猪场进行流行病学调查,对191只疑似猪瘟发病猪进行RT-PCR检测,结果表明,猪瘟阳性检出率平均为77.4%。     

RT-PCR技术快速检测烟草丛顶病研究

烟草丛顶病 (ｔｏｂａｃｃｏｂｕｓｈｙｔｏｐｄｉｓｅａｓｅ)是近年来在我国云南省西部的保山、大理、楚雄等烟区爆发流行的一种毁灭性烟草病害。截至 2 0 0 1年 ,云南省累计发病面积达 4万ｈｍ2 ,平均发病率约为1 5 % ,造成了上亿元的经济损失。该病的病原物研究长期处于争论状态 ,被暂时命名为“云南烟草丛枝病 (ｔｏｂａｃｃｏｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍｄｉｓｅａｓｅ)” ,植原体学说、新的病毒病学说等都曾经长期占据人们的视野。Ｍｏ等明确了该病是由烟草丛顶病毒 (Ｔｏｂａｃｃｏｂｕｓｈｙｔｏｐｖｉｒｕｓ ,ＴＢＴＶ)和烟草脉扭…     

甘蔗黄叶病毒病早期快速RT-PCR诊断和鉴定

甘蔗黄叶病毒病（YLS）是一种由黄症病毒（Luteorirus）引起,随种蔗传带的新病害。利用由黄症病毒组特征片段克隆测序设计的特异性引物对YLSR462和YLSF111开发出一种可以早期快速检测无症甘蔗繁殖材料带毒情况的反转录多聚酶链式反应技术（RT-PCR）。对来自世界各地美国甘蔗主产区的140个甘蔗品种及育种材料进行了检测,黄症叶片样品RT-PCR阳性检出率为100%,而无症样品带毒率为55.17%。与DAS-ELIS相比,显症和无症样品的检测符合度分别为76.47%和56.24%,表明分子诊断较血清学方法灵敏。而单纯采用叶片糖分锤度单一指标诊断YLS是不可靠的。美国的主栽甘蔗品种和大部分育种材料（95.0%）对于YLS均表现感病或带毒。为引种和品种选育提供了参考依据。     

水稻黑条矮缩病毒的RT-PCR检测

水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)病是一种以灰飞虱为主要介体进行传播的病毒病,主要侵染禾谷类作物和禾本科杂草[1 , 2 ].病株症状为浓绿矮缩,叶片僵直,不抽穗或穗小,叶背的叶脉和茎杆上有短条瘤状突起,该突起在发病初期呈腊白色,后变为黑褐色.发病田块一般减产10%～40%,重病田甚至颗粒无收[3 ～ 5].该病曾于20世纪60年代中期在我国华东诸省市不少地区广泛发生,此后20年发病面积逐年下降,但90年代以来,该病又迅速回升流行[6 ～ 8].该病毒属呼肠孤病毒科(Reoviruses)斐济病毒属(Fijivirus),有10条双链RNA[9].由于该病毒只能由特定的昆虫(以灰飞虱为主)带毒传播,在该病毒的科学研究和生产预测预报中,测定介体昆虫灰飞虱带毒率和水稻植株被感染率显得十分必要.本文根据该病毒的已知序列合成特异引物,建立了植株以及昆虫体内该病毒的RT-PCR检测法.     

猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立和临床应用

根据猪瘟病毒5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和Taqman探针,建立Taqman实时定量RT-PCR检测猪瘟病毒法。检测结果显示,该方法的灵敏度为1μl 10拷贝,在病毒拷贝数为1μl 108～101时,循环数(Ct)值与拷贝数对数呈现较好的线性关系,且重复性好,批间变异系数小于1%。用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒,结果均为阴性。用该方法检测采集自江苏和新疆的192份组织和血清样品,猪瘟病毒阳性率为71.9%;检测感染猪的不同脏器,发现在心、肺、肝、肾、脑、脾脏、淋巴结、腹水中均可以检测到猪瘟病毒,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高。该方法的建立为猪瘟病毒的流行病学调查和定量提供了有效手段。     

牛病毒性腹泻/黏膜病RT-PCR 3种体系的试验研究

根据牛病毒性腹泻/黏膜病病毒5′端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/黏膜病病毒244 bp片段的RT-PCR 3种体系。该3种体系对牛病毒性腹泻/黏膜病病毒NADL、Oregon C24V和长春184毒株各标准毒株的检测结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。证明3种体系方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的RT-PCR技术3种体系可用于牛病毒性腹泻/黏膜病的检测及流行病学调查。     

应用RT-PCR检测歇马杏李属坏死环斑病毒

利用作者已建立的PNRSV RT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产歇马杏田间植株携带PNRSV的情况进行了调查,结果表明被检植株PNRSV的感染率达83.33%,但带毒程度不同。     

Study on PCR rapid molecular detection technique of Meloidogyne vitis

Meloidogyne vitis is a new root-knot nematode parasitic on grape root in Yunnan Province, China.  In order to establish a rapid, reliable and specific molecular detection method for M. vitis, the species-specific primers were designed with rDNA-ITS (ribosomal DNA internal transcribed spacer) gene fragment as the target.  The reaction system was optimized and the reliability, specificity and sensitivity of primer were testified, therefore, a rapid PCR detection method for M. vitis was established.  The result showed that the optimal annealing temperature of the primers was 53°C, which was suitable for the detection of different life stages of M. vitis.  Specificity test showed that the specific fragment size of 174 bp was obtained from M. vitis, but other five non-target nematodes did not have any amplification bands, thus effectively distinguish M. vitis and the other five species, and could specifically detect the M. vitis from mixed populations.  Sensitivity test showed that this PCR technique could detect the DNA of a single second-stage juvenile (J₂) and 10^–4 female.  Futhermore, this PCR technique could be used to detect directly M. vitis from soil samples.  The rapid, sensitive and specific PCR molecular detection technique could be used for the direct identification of a single J₂ of M. vitis and the detection of M. vitis in mixed nematode populations and the detection of two J₂s or one male in 0.5 g soil samples, which will provide technical support for the investigation of the occurrence and damage of M. vitis and the formulation of efficient green control strategies.     

猪血凝性脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法,根据GenBank中HEV的HE基因和S基因设计了1对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,成功的扩增出323bp的特异性条带。检测与HEV亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性,最低可以检测到10个TCID50/100μl的病毒,说明该方法的有较好的特异性和敏感性。用此RT-PCR方法对感染HEV的小鼠和猪进行检测,结果能从发病动物的多种组织中检测到病原,其中以脑组织的检出率最高。因此,临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本。     

二重PCR快速检测牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的研究

根据伊氏锥虫ITS序列（FJ416612）和GenBank报道的牛巴贝斯虫棒状结合蛋白1序列（FJ588013）,设计合成2对特异性诊断引物,建立了牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的二重PCR诊断方法。结果表明,建立的二重PCR诊断方法可扩增出牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的特异性条带,大小分别为213bp和360bp,最低检出量分别为4．00pg和0．38pg。但对牛双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫、环形泰勒虫、附红细胞体、巴氏杆菌不敏感。用该二重PCR方法对95份水牛样品和134份奶牛样品进行检测,结果发现,水牛伊氏锥虫的感染率为13．7％（13／95）、牛巴贝斯虫的感染率为7．4％（7／95）,无混合感染;奶牛伊氏锥虫的感染率为3．7％（5／134）、牛巴贝斯虫的感染率为0（0／134）。说明该二重PCR方法具有敏感、快速、特异的特点,适用于牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的流行病学调查。     

Rapid detection of Pseudomonas aeruginosa by cross priming amplification

Pseudomonas aeruginosa(PA) is an opportunistic pathogen of humans and animals and a common source of nosocomial infections especially of the respiratory tract. Pseudomonas aeruginosa is also a major bacterial disease of poultry and in particular, eggs and newly hatched chicks. In this study, we developed a simple, accurate and rapid molecular detection method using cross priming amplification(CPA) with a nucleic acid test strip to detect P. aeruginosa. The assay efficiently amplified the target gene within 45 min at 62°C only using a simple water bath. The detection limit of the method was 1.18×10~2 copies μL~(–1) for plasmid DNA and 4.4 CFU mL~(–1) for bacteria in pure culture, and was 100 times more sensitive than conventional PCR. We screened 83 clinical samples from yellow-feather broiler breeder chickens and hospitalized/treated dogs and cats using CPA, PCR and traditional culture methods. The positive-sample ratios were 15.3%(13/83) by CPA, 13.3%(11/83) by PCR and 12.1%(10/83) by the culture method. The established CPA method has significant advantages for detecting P. aeruginosa. The method is easy to use and possesses high specificity and sensitivity without the requirements of complicated experimental equipment. The PA-CPA assay is especially fit for outdoor and primary medical units and is an ideal system for the rapid detection and monitoring of P. aeruginosa.     

鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR检测方法的建立和应用

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种新发现可引起鸭产蛋下降的新型黄病毒,建立一种病原学检测方法对于疫病的诊断和流行病学研究具有重要意义。在对DTMUV序列的比对分析的基础上,设计了1对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立了DTMUV的一步法RT-PCR检测方法。该方法具有特异、快速、敏感、准确等特点,可以检出1.82个TCID50的病毒核酸。对2010年至2011年6月份前的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测,结果显示样品阳性率为46.2%,表明DTMUV在浙江及其周边省份的产蛋鸭群具有较高的感染率。     

实时荧光PCR 法特异性检测棉花曲叶病毒

根据棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus,CLCuV)运动蛋白基因序列特征,设计并合成了特异性Taqman探针和检测引物,建立该病毒的实时荧光PCR快速检测方法。结果表明:该方法可以特异性地从5个不同CLCuV分离物中扩增到荧光信号,而其他6种病毒均无扩增。建立的方法具有快速、准确、灵敏及简便等特点,可为进出境植物检疫和农业安全生产提供可靠的技术支持。     

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR（multiplex　PCR）条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法。通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明：该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增茵4～8h其最低检出限可达1cfu／mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域。