白斑综合征病毒(WSSV)在几种经济类淡水甲壳动物中的感染与流行调查研究

2007年江苏、浙江等地暴发养殖克氏原螯虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)病,2008年该病在江苏地区进一步蔓延,调查发现,在一些虾蟹混养池塘,中华绒螯蟹也有批量死亡的现象.本研究通过采集发病池塘中的克氏原螯虾、中华绒螯蟹与日本沼虾,将上述3种淡水甲壳动物进行超薄切片透射电子显微镜观察,同时利用建立的WSSV特异性引物PCR方法进行检测.试验结果表明,在上述3种淡水甲壳动物中均发现类似WSSV颗粒,PCR检测进一步证实已感染WSSV.流行病学调查及人工回感试验表明该病毒对克氏原螯虾和中华绒螯蟹具有较强毒性,日本沼虾则无明显发病症状.     

浙江省4个地区克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的检测分析

随着市场需求的日益增大,克氏原螯虾的养殖规模不断扩大,但克氏原螯虾养殖业却深受白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的威胁。本次研究主要调查浙江省4个地区克氏原螯虾的WSSV携带情况和WSSV阳性感染率与季节温度变化的相关性。本研究检测了4—8月浙江省4个地区螯虾WSSV阳性感染率和阳性螯虾的血淋巴、鳃、肠的病毒拷贝数。综合4个地区每月实验数据,发现在2026 ℃时,4个地区的螯虾WSSV阳性率都可达60%以上,4—6月为WSSV发病的高危时期,到8月随着水温超过26 ℃螯虾WSSV阳性率显著下降。检测发现在鳌虾的血淋巴、鳃、肠中病毒最低的拷贝数为10³,最高的拷贝数为10¹⁰,这说明病毒会长期潜伏感染,等待温度及其他条件合适时再大量复制。本研究将为在克氏原螯虾养殖过程中防治WSSV提供科学依据。     

克氏原螯虾WSD的PCR诊断及组织病理损伤研究

【目的】近年来白斑综合症病毒(WSSV)严重威胁着克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的健康养殖,本研究旨在确定一例克氏原螯虾暴发性死亡的病因。【方法】对患病虾进行临床症状观察,取其鳃、心脏、肝胰腺、肠道、肌肉、眼睛等组织分别进行套氏PCR检测和组织病理学观察。【结果】患病虾临床剖解特征表现为肠段中空无食物,肠壁透明,肠管较细;套氏PCR结果显示患病虾体内WSSV呈阳性;PCR产物测序并进行系统发育树分析显示,该基因序列与WSSV的核苷酸序列同源性为100%,进一步证实本次患病克氏原螯虾体内携带WSSV。病理组织切片显示,该病靶器官主要为肝胰腺、心脏、鳃、肠道,患病虾均表现为中度至重度坏死性肝胰腺炎、中度充血性鳃炎、中度坏死性心肌炎、以及轻度肠炎,肌肉组织未发现明显病变。【结论】推断造成本次克氏原螯虾大量死亡的原因为WSSV感染。     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。     

对虾白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾体内的动态分布

从江苏射阳某对虾养殖场采集患白斑综合征的病死对虾，以对虾组织镁浆液接种克氏原螯虾并传至2代。结果螯虾全部发病死亡。用斑点杂交和单抗ELISA检测对虾和2代螯虾，均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性，将此WSSV命名为射阳株，进一步用斑点杂交和单抗ELISA检测射阳株在肌注和口服感染螯虾体内的动态分布，并与青岛株的动态分布相比较。口服和肌注螯虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中检出，然后减少，36h后又明显检出，并增加至高峰然后减少；肠上皮、心脏、肌肉中的病毒在口服和肌注感染后36h同时出现并呈总体递增分布；此外，病毒在胃上皮、真皮和结缔组织中也有不同程度的分布。感染死亡螯虾各主要组织器官均可检出病毒；电镜观察死亡螯虾鳃、心脏、肝胰腺、直皮、卵巢等器官的超薄切片，均可见到典型的病毒粒子，显示死亡螯虾内病毒已形成周血感染。WSSV射阳株与青岛株在螯虾的动态分布具有相似性。     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒和虾虹彩病毒检测及分析

2020年检测安徽省滁州、安庆和合肥的20个稻田养殖的200只克氏原螯虾(Procambarus clarkii)鳃组织中白斑综合征病毒和虾虹彩病毒,结果发现白斑综合征病毒阳性检出率为97.5％,病毒含量达106拷贝/mg的检出率与克氏原螯虾死亡率呈正相关.虾虹彩病毒阳性检出率为13％,只在滁州的3个和合肥的2个稻田的养殖虾中检出.     

克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因功能初步研究

为探究硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶-1（chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1,CSGalNAcT-1）在克氏原螯虾免疫反应中的作用,利用RACE技术成功获得克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因完整cDNA序列,并通过荧光定量PCR分析该基因在各组织中的表达模式以及在CpG寡脱氧核苷酸（ODN）、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒（WSSV）刺激后的表达情况。结果显示,克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因在中肠的相对表达量最高,其次是近胃段肠,在心脏、胃、肌肉和围食道神经中的相对表达量较低。克氏原螯虾肝胰腺、血细胞中CSGalNAcT-1基因表达量在嗜水气单胞菌和WSSV刺激下呈现出下调及上调,而在注射免疫刺激剂CpG ODN后,CSGalNAcT-1基因表达水平在大部分组织中呈现上调。表明克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因可能在抵御外界病原侵染以及增强自身免疫反应的过程中发挥重要作用。     

克氏原螯虾雌雄分养状态下的性腺发育观察

克氏原螯虾具有多雄多雌交配行为,这一特性给克氏原螯虾家系选育工作带来了许多不便。为了获取克氏原螯虾(Procambarus clarkii)雌雄分开养殖下的性腺发育状况,本研究从苗种阶段开始对克氏原螯虾进行雌雄分开养殖,在江苏地区克氏原螯虾主要繁殖季节(9—12月),对雌雄分开养殖状态下克氏原螯虾的性腺发育情况进行了观察。9月所采集的雌性克氏原螯虾多处于性腺发育Ⅴ期(占20/30),卵巢呈深褐色,卵粒饱满均匀;11月所采集的克氏原螯虾样品的卵巢多数已退化(占22/30),卵巢中仅残存少量未成熟卵粒(或空腔),处于性腺发育Ⅵ期。组织切片观察结果显示,克氏原螯虾卵母细胞直径为2 000μm左右,细胞质中可见大量的卵黄颗粒;精巢呈长囊形,生精小囊多呈囊球状,生精小囊与收集管相连接,收集管中可见部分精子。研究结果提示,雌雄分开养殖对克氏原螯虾的性腺发育没有产生明显的不利影响,本研究为后续开展克氏原螯虾家系选育相关研究积累了数据。     

淡水螯虾传染性疾病的研究进展

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的人工养殖热潮正在我国部分地区兴起,由于养殖者缺乏饲养克氏原螯虾的经验和技术,随着养殖面积的迅速扩大,不明原因的疾病暴发性发生正在威胁着克氏原螯虾养殖的可持续发展.由致病性细菌、病毒和真菌引起的传染性疾病对人工养殖克氏原螯虾的危害严重.本文对克氏原螯虾传染性疾病和防治技术的国内外研究概况进行了综述,旨在为养殖者和研究人员提供借鉴.     

宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的检测与分析

为了解浙江宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的流行情况,为科学防控该病提供参考依据,应用PCR方法对2004～2008年采自宁波地区对虾养殖场的1201份南美白对虾样品进行WSSV检测。结果表明,1201份样品中有364份样品呈阳性,总阳性率为30.31%;2004～2008年的WSSV年平均阳性检出率均较高,且呈不规律变化,其中以2006年南美白对虾白斑综合征发病最严重,阳性感染率达42.66%,但2006～2008年WSSV的年平均阳性检出率呈下降趋势。     

对虾白斑综合症病毒PCR检测体系的优化研究

通过改进WSSVPCR模板制备方法、引物的筛选、PCR反应的优化,建立稳定的WSSVPCR检测体系。结果表明,该体系具有稳定、快速、灵敏等特点,可用于生产中对WSSV的检测。     

多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义.为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测.检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8 %;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5 %;桃拉病毒检出率为3.1 %;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒.该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数据高度吻合.实践证明,该实验建立的RT-PCR方法具有高度的准确性,与其他检测方法相比具有快速、简便的特点,在对虾病毒检疫、流行病学调查等方面具有重要的应用价值.     

不同靶点shRNA干扰对虾白斑综合征病毒增殖效果分析

设计合成了靶向对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组不同佗点的5个shRNA:RR9、RR1、DP1、DP2和PK1,并在凡纳滨对虾体内实施了RNA干扰(RNAi)抗WSSV增殖的试验.结果显示:5个shRNA不同程度地抑制了WSSV的复制,降低了对虾的死亡率,其中,靶向病毒核糖核酸还原酶的shRNA RR9的RNA干扰效果最佳.     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3.1（＋）-vp28的构建及其在细胞中的表达

[目的]为研究对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白与虾细胞之间的作用机制奠定基础。[方法]采用PCR扩增方法构建含白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的真核表达重组载体pcDNA3.1（＋）-vp28,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染到293T细胞中,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。[结果]VP28的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现出1条634bp左右的条带,与GenBank中vp28的序列完全一致。对pcDNA3.1（＋）-vp28转染后的阳性单克隆菌落进行PCR鉴定、扩大培养和质粒提取,并对所得质粒进行HindⅢ和BamⅢ双酶切,获得了5409和610bp左右的2条带,与预期结果一致;所获扩增产物与vp28序列完全一致,说明重组质粒pcDNA3.1（＋）-vp28被成功转染到293T细胞中;SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中的表达产物与预期结果相符。[结论]pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中可成功表达VP28。     

淡水养殖凡纳滨对虾IHHNV-WSSV共感染率调查分析及其对免疫相关酶活性的影响

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)均为需向OIE报告的虾类病毒,本研究于2014年对上海地区部分淡水养殖凡纳滨对虾WSSV和IHHNV的感染及共感染情况进行了跟踪、检测和人工感染分析。检测结果显示,WSSV和IHHNV平均单感染率分别为42.6%和38.5%,双病毒共感染率为20.5%,其中,IHHNV-WSSV共感染率与WSSV感染率呈正相关。病理和累计死亡率分析显示,尽管IHHNV-WSSV组的对虾累计死亡率比同一时间点WSSV组低,但是这两组濒死对虾鳃丝细胞的病变都很严重,病变程度无明显差异。免疫相关酶——超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶活性分析表明,IHHNV-WSSV共感染可以在一定程度上比单纯WSSV感染激起更高和更快些的免疫应答,但是,随着感染时间的延长,IHHNV-WSSV共感染表现出比WSSV单感染更长时间的免疫抑制。研究表明,虽然IHHNV-WSSV共感染可在一定时间范围和一定程度内降低对虾累计死亡率,但是共感染可造成病毒致病性的叠加和宿主更长时间的免疫保护低下,因此,IHHNV-WSSV共感染导致的损失可能比单病毒感染更大。     

白斑综合征病毒（WSSV）感染淡水枝角类的初步研究

采用WSSV发病对虾组织碎块投喂、WSSV粗提液投浸、WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌和酵母菌投喂对淡水枝角类进行白斑综合征病毒（WSSV）攻毒,然后将攻毒前后的淡水枝角类进行PCR检测。结果表明,投喂WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌可以感染淡水枝角类。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。