不同绵羊品种FSHR基因多态性及其与产羔数的关联分析

旨在探究阿勒泰羊、和田红羊、吐鲁番黑羊中FSHR基因g.75132817C>T、g.75320579G>A、g.75320741G>A突变位点的多态性与产羔数的关系，为高繁殖力绵羊的选育提供新的分子标记。利用竞争性等位基因特异性PCR（The kompetitive allele specific PCR genotyping system,KASP）技术对FSHR基因的3个突变位点进行分型，利用SPSS 19.0进行关联分析。结果表明，g.75132817C>T位点在3个群体中均表现为中度多态（025A和g.75320741G>A位点在3个群体中均为低度多态 （PIC<0.25）。g.75132817C>T位点中，和田红羊突变型TT个体产羔数显著高于野生型CC个体（P< 0.05）。g.75320579G>A位点中，阿勒泰羊野生型GG个体产羔数显著高于杂合型GA个体。g.75320741G>A位点中，阿勒泰羊野生型GG个体产羔数极显著高于杂合型GA个体和突变型AA个体；吐鲁番黑羊突变型AA个体产羔数显著高于野生型GG个体。因此，推测FSHR基因g.75132817C>T位点适用于和田红羊产羔数的选育；g.75320741G>A位点适用于吐鲁番黑羊产羔数的选育。     

大别山牛PAX3基因多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】探究PAX3基因多态性与大别山牛生长性状的相关性。【方法】采集292头安徽大别山成年（24～48月龄）母牛的耳组织,并测定其体尺数据,提取DNA后,通过PCR和测序技术鉴定出大别山牛群体中PAX3基因的多态性,利用POPGENE、Haploview和SHEsis软件,分别对多态位点进行遗传多样性、哈代 温伯格平衡和单倍型分析,利用SPSS 23.0软件分析其与生长性状的相关性。【结果】在大别山牛PAX3基因第4内含子中检测到3个SNPs位点（g.4718G>C、g.4744T>C和g.4757C>A）,第6内含子中检测到1个SNPs位点（g.78920C>T）,4个SNPs位点均存在3种基因型。遗传多样性分析发现,g.4718G>C位点属于低度多态（PIC≤0.25）,g.4744T>C、g.4757C>A和g.78920C>T位点均属于中度多态（0.25A外,其余3个位点均处于哈代-温伯格平衡状态（P>0.05）。单倍型分析发现,4个SNPs位点间无强连锁相关（r²<0.33）,形成13种单倍型,其中频率大于0.03的单倍型有6个。相关性分析发现,g.4718G>C位点与大别山牛的十字部高显著相关(P<0.05);g.4744T>C位点与十字部高、腹围和腰角宽极显著相关(P<0.01);g.4757C>A位点与腰角宽显著相关(P<0.05);g.78920C>T位点与腹围极显著相关(P<0.01),与管围显著相关(P<0.05)。【结论】PAX3基因第4内含子的g.4718G>C、g.4744T>C 和g.4757C>A位点以及第6内含子的g.78920C>T位点多态性与大别山牛群体部分生长性状具有显著或极显著的相关性,可以作为大别山牛遗传选育的候选分子标记。     

牦牛SMAD4基因SNPs检测及其与生长性状的关联分析

【目的】研究牦牛SMAD4基因SNPs与生长性状的关系，探寻与牦牛生长性状相关的分子标记。【方法】采用DNA测序和单倍型分型技术，对青海牦牛SMAD4基因进行SNPs检测及其基因分型、连锁不平衡和单倍型分析，并对多态位点的基因型及组合单倍型与牦牛生长性状的关联性进行分析。【结果】牦牛SMAD4基因在内含子区域存在6个突变位点，其中g.393A>G、g.555A>G、g.6525A>G和g.18360C>T均存在3种基因型，g.582A>T和g.6492C>T均存在2种基因型。连锁不平衡分析发现，6个位点间不存在强连锁不平衡效应。单倍型分析发现，在14种不同的单倍型中，单倍型H₁的发生频率最高。关联性分析表明，g.393A>G位点与体斜长、胸围和管围均显著相关（P<0.05），g.555A>G位点与体斜长显著相关（P<0.05），g.582A>T位点与体质量和体高均显著相关（P<0.05），g.6492C>T位点与体高显著相关（P<0.05），g.6525A>G位点与体质量显著相关（P<0.05），g.18360C>T位点与胸围显著相关（P<0.05）。基因型组合发现，单倍型H₁H₁₄可能是影响牦牛生长性状的最优组合。【结论】牦牛SMAD4基因内含子区域上的6个位点与生长性状显著关联，可作为牦牛分子标记辅助选择的候选基因。     

青海高原型牦牛GHR基因多态性与生长发育的关联性

【目的】探索青海高原型牦牛（Bos grunniens）生长激素受体（growth hormone receptor）基因GHR多态性及其与生长性状的关联性。【方法】以440头同等放牧条件下的30~36月龄健康牦牛为试验群体，PCR扩增其GHR基因，测序后用DNASTAR 7.1软件分析单核苷酸多态性（SNP）位点，研究不同基因型及其合并基因型与生长发育指标（体质量、体高、体斜长、胸围和管围）的关联性。【结果】青海高原型牦牛GHR基因上存在g.732091C>G、g.732195A>G和g.732373G>A 3个SNP位点，其中g.732195A>G上存在2种基因型（AA,AG），g.732091C>G和g.732373G>A上各存在3种基因型（分别为CC、CG、GG和GA、AA、GG）；卡方检验表明，g.732091C>G、g.732195A>G和g.732373G>A均处于Hardy-Weinberg极度不平衡状态，且g.732195A>G为低度多态（PIC＜0.25），g.732091C>G和g.732373G>A为中度多态（0.25G、g.732195A>G和g.732373G>A能够显著或极显著影响高原型牦牛的体质量和胸围，优势基因型分别为g.732091C>G和g.732373G>A的GG以及g.732195A>G的AA。对合并基因型分析发现，合并基因型 GG-AA-GG个体的生长发育尤其是体斜长表现最佳。【结论】青海高原型牦牛GHR基因有3个SNP位点，因其与青海高原型牦牛的部分生长性状相关，可作为牦牛分子标记辅助选择的候选基因。     

策勒黑羊GDF9和BMP15基因多态性与产羔数关联分析

为了鉴定策勒黑羊BMP15和GDF9中的多态位点,并与产羔数性状进行关联分析,对相同饲养条件下81只具有产羔记录的策勒黑羊BMP15和GDF9基因完整ORF区进行测序。结果显示,在两个重要候选基因中共存在16个多态位点。GDF9基因有7个SNPs（分别为g.41769976G＞A、g.41769833G＞A、g.41769898G＞A、g.41769246A＞G、g.41769008T＞C、g.41769002A＞G）和g.41769723 TCAA缺失,其中：g.41769833G＞A 位点AA型比GG型平均多0.22只（P＜0.05）,其余6个突变位点均与产羔数不存在显著相关（P＞0.05）。BMP15基因存在9个突变位点：g.50986052C＞A、g.50985229A＞G、g.50985162T＞C、g.50985071C＞T、g.50983056C＞G、g.50982538T＞C、g.50981129A＞G、g.50980656T＞C和g.50981170T＞A,且这9个SNP位点与产羔数均不存在显著相关（P＞0.05）。结果可为策勒黑羊种群的保种育种提供理论参考。     

哈萨克羊iNOS基因多态性与布鲁菌易感性的关系

【目的】探究哈萨克羊诱导型一氧化氮合酶基因（iNOS）多态性与布鲁菌易感性的关系。【方法】使用虎红平板凝集试验（RBPT）进行哈萨克羊布鲁菌病血清学检测。参考GenBank中绵羊iNOS基因序列,针对其2,4,5外显子及其邻近内含子片段（exon 2/intron,exon 4/intron and exon 5/intron）设计引物,采用PCR-SSCP和DNA测序技术对231只哈萨克羊的iNOS基因进行多态性检测,分析其单核苷酸多态性（SNPs）与布鲁菌易感性之间的关系。【结果】经检测发现67只哈萨克羊为布鲁菌感染阳性,阳性检出率为29.00%。在哈萨克羊iNOS基因的exon 2/intron片段上检测出F2-C1910T多态位点,检测到CC、CT 2种基因型,优势等位基因和基因型分别是C和CC,其频率分别是0.924和0.848。在exon 4/intron片段上检测出F4-T11519C和F4-A11546G两个多态位点,其中F4-T11519C位点有2个等位基因T、C,有TT、CC、TC 3种基因型,优势等位基因和基因型分别是T和TC,其频率分别是0.714和0.528;F4-A11546G位点有2个等位基因A、G,有AA、AG、GG 3种基因型,优势等位基因和基因型分别是A和AG,其频率分别是0.714和0.528。在exon 5/intron片段上检测出F5-C12707T位点,有2个等位基因C、T,有CC、TT、CT 3种基因型,优势等位基因和基因型分别是C和CT,其频率分别是0.600和0.506。F2-C1910T位点为低度多态性位点,F4-T11519C、F4-A11546G和F5-C12707T位点为中度多态性位点。χ²检验表明,哈萨克羊iNOS基因F2-C1910T和F5-C12707T位点与布鲁菌易感性的相关性不显著（P＞0.05）,F4-T11519C和F4-A11546G位点与布鲁菌易感性的相关性极显著（P＜0.01）。哈萨克羊iNOS基因F2-C1910T位点的易感基因型为CC,F4-T11519C位点的易感基因型为TT、TC,F4-A11519G位点的易感基因型为AA、AG,F5-C12707T位点的易感基因型为CC、CT。【结论】哈萨克羊iNOS基因F2-C1910T和F5-C12707T位点与布鲁菌易感性无相关性,F4-T11519C和F4-A11546G位点与布鲁菌易感性存在相关性。     

POU1F1基因多态性与藏羊生长性状的关联性分析

【目的】探讨POU1F1基因的多态性与藏羊生长性状之间的关联性,寻找与藏羊生长性状相关的分子标记。【方法】利用DNA测序方法检测藏羊POU1F1基因的多态位点并对其进行基因分型,分析单一多态位点不同基因型及双倍型与藏羊生长性状的关联性。【结果】在POU1F1基因第4内含子上检测出1个多态位点g.14205GA,在第5内含子上检测出2个多态位点g.15223GA和g.15286AG。关联性分析表明,g.14205GA位点上AA基因型的体质量和体长分别极显著(P0.01)和显著(P0.05)高于GG和AG基因型;g.15223GA位点上GG基因型的体质量显著高于GA基因型(P0.05),极显著高于AA基因型(P0.01);g.15286AG位点AA基因型体质量极显著高于GG基因型(P0.01),体高显著高于GG基因型(P0.05)。单倍型Hap7(-GGA-)的发生频率最高,达到42.40%,其次为单倍型Hap5(-GAA-)和单倍型Hap3(-AGA-),发生频率分别为21.50%和14.70%。此外,POU1F1的r2值均小于0.33,说明这3个多态位点之间不存在强的连锁性。通过合并基因型发现,双倍型H7H7(GGA-GGA)的各个生长性状表现最优。【结论】POU1F1基因的3个SNP位点可用于藏羊生长性状的选育。     

BMP7基因单核苷酸多态性与猪繁殖性状的关联分析

为探讨 BMP7基因遗传变异对杜洛克猪、豫南黑猪繁殖性状的影响。采用PCR RFLP方法检测猪 BMP7基因在杜洛克猪和豫南黑猪中的多态性分布,并分析位点基因型与猪繁殖性能的关联。检测结果表明,杜洛克猪和豫南黑猪群体 BMP7外显子2上T98C和T143C均由碱基T突变为C,属同义突变。多态位点均以A 为优势等位基因,T98C位点AA基因型占总基因型的50.5%,优于AB基因型（38.1%）与BB基因型（11.4%）（呈AA>AB>BB趋势）。该位点AA型个体的总产仔数、产活仔数、出生窝质量、21日龄窝质量显著高于AB型（P<0.05）;T143C位点AA基因型占总基因型的38.8%,优于AB基因型（38.0%）与BB基因型（23.1%）（呈AA>AB>BB趋势）。该位点不同基因型个体的总产仔数,产活仔数和初生质量在不同基因型之间均差异显著（P<0.05）。研究结果说明, BMP7基因多态位点与母猪繁殖性能显著相关,可以用于猪分子遗传育种的候选基因。     

东湖F1代BMPR-1B和BMP15基因多态性 与产羔性能关联性分析

为探究候选基因BMPR-1B、BMP15与东弗里生羊♂和湖羊♀的杂交F₁代（东湖F₁羊）产羔数间的关联性，评估东弗里生羊作为引入品种的经济利用价值，使用PCR-RFLP技术对东湖F₁羊和湖羊的BMPR-1B、BMP15基因多态性与产羔数进行关联分析。结果显示，东湖F₁羊与湖羊群体内均未检测出BMP15基因的FecX^I突变。BMPR-1B基因FecB突变位点在湖羊群体中检测出AG、GG两种基因型，基因频率分别为0.064和0.936，优势基因型为GG型，等位基因A、G的基因频率分别为0.032和0.968，优势基因为等位基因G；在东湖F₁羊群体中检测出AA、AG和GG 3种基因型，基因频率分别为0.146、0.683和0.171，优势基因型为AG型，等位基因A、G的基因频率分别为0.488和0.512。表明对产羔有利的G等位基因可以通过东弗里生和湖羊杂交遗传给后代，可作为其分子育种的辅助选择标记。湖羊AG型与GG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05），东湖F₁羊 GG型、AG型个体产羔数极显著高于AA型个体（0.01＜P＜0.05），GG型与AG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05）。结果表明东湖F₁羊产羔数与BMPR-1B基因显著相关。     

6个黄牛群体MyoG基因单核苷酸多态性及其与体尺性状的相关性

【目的】研究牛肌细胞生成素基因(MyoG)第2、3外显子及其侧翼区单核苷酸的多态性(SNPs),分析其与牛部分体尺性状的相关性。【方法】以6个牛群体（鲁西牛、鲁杂牛（鲁西牛×西门塔尔牛）、南阳牛、夏南牛、郏县红牛、秦川牛）共779头3～4岁左右母牛为研究材料,通过PCR-SSCP和DNA测序技术检测牛MyoG基因上存在的SNPs,并分析其与牛部分体尺性状的关联性。【结果】MyoG基因第2外显子及其侧翼区的扩增片段中不存在多态性,第3外显子及其侧翼区的扩增片段中存在3种基因型(AA、AB、BB),测序结果表明该突变位于3′-UTR 2 109位点处。最小二乘法分析表明,各群体中AA基因型个体的体斜长均显著高于BB基因型个体(P＜0.05);鲁西牛群体中AA基因型个体的尻长显著高于BB基因型(P＜0.05);郏县红牛群体中AA基因型个体的体高显著高于BB基因型(P＜0.05)。3种基因型对其他体尺性状没有显著影响(P＞0.05)。【结论】MyoG基因对黄牛体尺性状有一定影响,可作为黄牛体尺性状标记辅助选择的候选基因。     

3个牛品种UCP3基因第5内含子和第6外显子部分序列的多态性研究

以中国西门塔尔牛、安格斯牛和海福特牛为试验材料,设计特异性引物扩增解耦联蛋白3基因(UCP3)的第5内含子和第6外显子部分序列,利用PCR-SSCP技术对牛UCP3基因进行了SNPs检测和基因型分析。结果表明,3个牛品种中的优势等位基因均为B,中国西门塔尔牛和安格斯牛的优势基因型为BB型,海福特牛的优势基因型为AB型;中国西门塔尔牛和海福特牛在UCP3基因位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,而安格斯牛在UCP3基因位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态;中国西门塔尔牛和海福特牛在UCP3基因位点为中度多态,安格斯牛在UCP3基因位点为高度多态。     

桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

  目的  探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。  方法  根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37 ℃)和200 mg·L?1脱落酸处理,分析启动子活性。  结果  获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明:3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型元件参与防御和胁迫的元件;在OfHYB启动子中,存在生长素、乙烯、茉莉酸甲酯等激素响应元件、低温响应元件和厌氧诱导型元件。烟草瞬时转化试验表明:相对高温能激活OfPSY、OfPDS和OfHYB的启动子活性,脱落酸能激活OfPDS和OfHYB的启动子活性。  结论  高温和脱落酸可能通过调控桂花类胡萝卜素合成基因启动子活性,影响桂花类胡萝卜素的积累。图4表5参28     

绵羊繁殖轴相关组织TPH1和TPH2基因表达分析及TPH2基因多态性与产羔数的关系

为探讨TPH1和TPH2基因在绵羊不同繁殖状态下的表达差异及TPH2基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系,利用实时荧光定量PCR技术检测该2个基因在不同繁殖状态下成年苏尼特羊(短光照3只,长光照3只)和小尾寒羊(卵泡期3只,黄体期3只)的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏和肾上腺等10种组织中的相对表达量;同时采用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测TPH2基因单核苷酸多态位点SNP在常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并将基因多态性与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:该2个基因在2个绵羊品种各组织广泛表达,TPH1基因在苏尼特羊下丘脑和松果体中短光照表达量极显著高于长光照(P0.01),在苏尼特羊垂体中短光照表达量显著高于长光照(P0.05),在小尾寒羊垂体和卵巢中卵泡期显著低于黄体期(P0.05);TPH2基因在苏尼特羊卵巢组织长光照下的表达量显著高于短光照(P0.05),TPH2基因在小尾寒羊下丘脑组织中卵泡期的表达量极显著高于黄体期(P0.01)。小尾寒羊中TPH2基因g.107854166CT和g.1078541669CT 2个SNP位点关联分析表明,该2个位点与季节性发情性状和小尾寒羊第1、2以及第3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。综上,TPH1和TPH2基因在苏尼特羊绵羊下丘脑和松果体中呈季节性光照节律差异表达,暗示其可能参与季节性发情上游基因的调控,而TPH2基因可能参与调控小尾寒羊下丘脑中激素分泌和卵巢发育,但g.107854166CT和g.1078541669CT不是调控季节性发情和小尾寒羊产羔数的关键位点。     

锈色粒肩天牛幼虫的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段序列分析

  目的  基于分子生物学手段，探讨可快速准确鉴别锈色粒肩天牛Apriona swainsoni幼虫与其他天牛幼虫的目标基因，为该保健昆虫的食药用安全提供保障。  方法  利用线粒体COⅠ、COⅡ、Cytb基因和28S细胞核基因的通用引物分别克隆获得4种基因片段，并进行同源序列检索、多重比对、序列信息分析及进化树构建。  结果  基因克隆最终获得锈色粒肩天牛4种基因序列的片段大小分别为817、545、434和1 088 bp。特殊位点分布结果显示:28S的保守位点占比最高，其后依次为Cytb、COⅠ和COⅡ，变异率则正好相反。COⅠ、COⅡ和Cytb基因片段的碱基组成和替换信息特点均表现为A+T含量>G+C含量，颠换高于转换，28S基因片段则表现为A+T含量  结论  COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因均可作为鉴定该虫的分子生物学参考依据。     

草酸青霉和棘孢木霉对青枯劳尔氏菌的生防效果

  目的  探究自主筛选获得的2株生防菌棘孢木霉Trichoderma asperellum QZ2与草酸青霉Penicillium oxalicum QZ8对青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)的生防效果。  方法  以青枯菌作为靶标菌,通过平板培养法、生长曲线法测定2株生防菌及其发酵液对青枯菌生长的抑制作用;通过土培试验、基于稀释涂布法测定生防菌在土壤中对青枯菌的抑制效果。  结果  平板对峙培养试验发现:棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌有显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达80.9%和45.9%;棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8生防菌高温灭菌发酵液对平板培养青枯菌,同样呈显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达33.3%和34.8%。无菌滤膜处理的未高温灭菌2株生防菌发酵液的青枯菌液培养结果表明:其D(600)显著小于未添加生防菌发酵液的对照D(600)(P＜0.05),且棘孢青霉QZ8抑制效果好于草酸木霉QZ2。土壤培养结果显示:2株生防菌处理的土壤中青枯菌的活菌数量显著低于未添加生防菌的对照(P＜0.05)。  结论  棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌均有显著的抑制效果,可作为番茄Lycopersicon esculentum青枯病的潜在生防菌。图5表2参32     

金黄色葡萄球菌氟喹诺酮的耐药性与grlA、grlB突变的关系

为了探讨金黄色葡萄球菌的氟喹诺酮耐药性与grlA、grlB基因突变的关系,从52株野生型金黄色葡萄球菌中筛选出1株对氟喹诺酮敏感的金黄色葡萄球菌,对其进行耐药诱导,获得一系列不同氟喹诺酮耐药水平的金黄色葡萄球菌,并对其grlA、grlB基因进行PCR扩增、测序及序列分析。结果表明,金黄色葡萄球菌的氟喹诺酮耐药性与grlB基因突变无关,而与grlA的丝氨酸(Ser)80→苯丙氨酸(Phe)和谷氨酸(Glu)84→赖氨酸(Lys)突变密切相关。金黄色葡萄球菌grlA的80位氨基酸和84位氨基酸双突变是其氟喹诺酮耐药性提高的标志之一。     

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

  目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28     

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

猪TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因遗传变异分析及其真核表达研究

【目的】研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒ORF3a和ORF3b基因序列,分别设计合成1对特异性引物,通过RTPCR从猪传染性胃肠炎病毒HN-2012株的cDNA中扩增ORF3a和ORF3b基因,经克隆测序后,将其基因序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析,然后将ORF3a和ORF3b基因亚克隆至真核表达载体,构建pCAGGS-ORF3a-flag和pCAGGS-ORF3b-flag载体,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体对2个基因的蛋白表达情况进行Western blot分析。【结果】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与其他毒株间核苷酸的同源性为92.6%~100%,ORF3b基因与其他毒株间核苷酸的同源性为98.6%~99.7%。Western blot结果表明,ORF3a蛋白和ORF3b蛋白的分子质量约为8ku和28ku。【结论】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与CH/JLY2/08、CH/HLJH/08株等亲缘关系较近,ORF3b基因与TS株、Miller M6株等亲缘关系较近,与我国其他毒株关系较远;成功实现了ORF3a和ORF3b蛋白在293T细胞中的表达。