小麦内生固氮菌分离及其ACC脱氨酶测定

【目的】了解小麦内生固氮菌数量,筛选具有ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate, 1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶活性的小麦内生固氮菌,确定筛选菌株的系统发育地位与分类地位,为微生物肥料生产收集菌种资源。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养法筛选内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;采用ACC唯一氮源法筛选ACC脱氨酶阳性菌,比色法定量测定ACC脱氨酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育;通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列比对鉴定菌种。【结果】小麦体内固氮菌数量为（0.2—17.8）×105 cfu•g-1鲜重;分离到小麦内生固氮菌60株,固氮酶活性在1—36 nmol C2H4/h•mg蛋白,其中9株具有ACC脱氨酶活性,活性在0.87—9.32 µmol α-丁酮酸/h•mg蛋白;新分离菌株9136固氮酶活性为1.82 nmol C2H4/h•mg蛋白,ACC脱氨酶活性为9.32 µmol α-丁酮酸/h•mg蛋白,初步鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。【结论】 田间自然生长的小麦体内有大量固氮菌,数量在105 cfu•g-1鲜重,其中部分菌株具有ACC脱氨酶活性,个别菌株具有较高的ACC脱氨酶活性,可能对作物抵御不良环境具有作用。     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30—30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12—254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27—59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33—205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23—46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30—254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

一株拮抗病原真菌的固氮菌Paenibacillus spGD812

 【目的】筛选具有拮抗病原真菌功能的固氮菌，研究菌株的固氮酶活性、nifH、生理生化特征、菌株抗逆性与接种效果等，并对该菌株进行鉴定，为微生物肥料生产筛选菌种资源。【方法】采用无氮培养基富集、筛选固氮菌，用对峙法筛选拮抗菌；乙炔还原法测定固氮酶活性，PCR扩增16S rDNA和nifH；通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种；采用温室盆栽小白菜试验接种效果。【结果】筛选到1株固氮菌GD812，该菌株固氮酶活性达到30.661 nmol C2H4/h•mg蛋白，同时具有拮抗麦类赤霉病菌（Gibberella zeae）和棉花黄萎病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）功能，抑菌率分别达到59.5%和49.3%；根据形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，GD812被鉴定为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.；该菌株的nifH基因长度300 bp，与Paenibacillus sp. Bs57 nifH基因序列相似性98%；GD812可以利用35种供试碳源中的20种，耐酸碱pH4—11，在4—50℃均可生长，盆栽试验接种比对照小白菜鲜重增加52%。【结论】固氮菌GD812被鉴定为类芽孢杆菌，该菌株利用碳源广泛，抗逆性强，具有较高的固氮酶活性和拮抗病原真菌能力，盆栽试验显示较好的接种效果，可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产菌种。     

块根块茎类作物内生固氮菌分离鉴定、系统发育与促生特性

【目的】分离鉴定块根块茎类作物内生固氮菌,研究块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育,分析测定块根块茎类作物内生固氮菌的促生特性,探讨块根块茎类作物内生固氮菌的种群特点及其随寄主植物的分布特征。【方法】表面消毒块根块茎样品后采用低氮培养法分离内生细菌;通过对菌株nifH的PCR扩增、测序确认分离细菌是固氮菌;通过16S rRNA基因测序、比对初步鉴定菌株,分析菌株的系统发育;通过测定菌株产生ACC脱氨酶、植物激素IAA,拮抗病原真菌研究菌株的促生特性。【结果】从胡萝卜、白萝卜、马铃薯、紫甘蓝、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜等14个块根块茎类作物的块根、块茎中共分离到内生固氮菌219株。基于16S rRNA序列,这些菌株在系统发育上分别属于Acinetobacter、Arthrobacter、Bacillus、Brevibacillus、Brevibacterium、Chryseobacterium、Citrobacter、Delftia、Domibacillus、Enterobacter、Fictibacillus、Flavimonas、Flavobacterium、Microbacterium、Micrococcus、Paenibacillus,Pantoea、Pseudomonas、Rahnella、Rhizobium、Sphingobacterium、Staphylococcus、Stenotrophomonas、Variovorax,共计24属79种,显示了块根块茎内生固氮菌丰富的种群多样性。鉴定结果显示,219株新分离菌株中有77株系统发育地位属于Bacillus属的23个种,29株属于Pseudomonas属的10个种,二者合计为33种106株,分别占系统发育种数和新分离菌株数的41.77%和48.40%,说明Bacillus和Pseudomonas属是新分离块根块茎类作物内生固氮菌的优势种群。从219株新分离菌株中选取了79株代表菌株进行促生特性研究,结果显示8.86%菌株检测到了ACC脱氨酶活性(0.026-13.76μmolα-丁酮酸·mg~(-1)蛋白·h~(-1)),64.56%菌株检测到了产IAA(0.34-28.99μg·mL~(-1)),6.33%-13.92%菌株具有拮抗病原真菌能力(抑菌率41%-63%)。【结论】在正常生长的块根块茎类作物的块根块茎内栖息着大量内生固氮菌;块根块茎类作物内生固氮菌在科学分类地位上分布广泛,达到24属79种,显示出巨大的生物多样性;Bacillus和Pseudomonas是块根块茎类作物内生固氮菌优势种群;大约10%-60%的块根块茎类作物内生固氮菌显示出产生ACC脱氨酶、产生植物激素IAA、拮抗病原真菌等促进植物生长特性,这可能是内生固氮菌有益于植物生长的内在原因。     

新造地马铃薯根际固氮解磷微生物的分离与鉴定

【目的】揭示马铃薯根际土壤固氮解磷菌类群,分析其固氮酶活性和溶磷能力,为利用新造地作物根际促生菌提供依据。【方法】以采自延安市安塞区新造地的马铃薯根际土壤为供试样品,采用Ashby培养基和无机磷培养基分离纯化马铃薯根际固氮解磷菌,以16S rDNA基因分析马铃薯根际微生物类群组成,以乙炔还原方法测定其固氮酶活性,以溶菌圈法和钼蓝比色法测定其溶磷能力。【结果】从延安新造地马铃薯根际土壤中分离并筛选到9株固氮解磷菌,经鉴定分别属于假单胞杆菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Paenarthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、贪噬菌属(Variovorax)、肠杆菌属(Kosakonia)和副球菌属(Paracoccus)等8个属;9株固氮解磷菌均具有固氮和溶磷特性,其固氮酶活性在11.88～95.08 nmol/h,其中菌株N34的固氮酶活性最高,且与其他菌株的固氮酶活性差异显著;9株固氮解磷菌株溶磷能力存在一定的差异,溶磷能力为22.05～54.9 mg/L,其中菌株N46的溶磷能力最好,7 d累积溶磷能力达到54.9 mg/L。【结论】分离纯化得到的9株固氮解磷菌均具有一定的固氮解磷能力,可用于开发马铃薯功能菌肥。     

螃蟹脚可培养内生细菌多样性及其促生活性研究

【目的】揭示螃蟹脚可培养内生细菌的多样性及其产IAA、铁载体及解磷、解钾能力,筛选具促生活性菌株,为后续植物内生细菌资源的开发与利用提供一定的基础数据和理论依据。【方法】以寄生植物螃蟹脚为研究材料,采用4种分离方法和5种不同培养基分离其内生细菌,通过16S rRNA基因序列对内生细菌进行鉴定,并构建系统发育进化树确定内生细菌的分类地位;从分离获得的螃蟹脚内生细菌中筛选具有ACC脱氨酶活性菌株,并对含ACC脱氨酶内生菌株的产IAA、铁载体及解磷、解钾能力进行测定。【结果】从螃蟹脚中共分离纯化获得60株内生细菌,通过16SrRNA测序及比对分析,去重复后共获得52株螃蟹脚内生细菌,分属于15科22属,其中以悬浮法（Z法）和纤维素—脯氨酸培养基（4号）的分离效果最佳,分别获得16和17个菌属,且以短小杆菌属（Curtobacterium）为优势菌属,占23.08%。促生能力测定结果表明,12株具ACC脱氨酶活性的内生细菌中7株菌（占58.33%）具有产IAA能力,其中菌株SWFU34产IAA能力最强,为4.95mg/mL;10株菌（占83.33%）具有产铁载体能力;8株菌（占66.67%）具解磷和解钾能力,其中有4株菌株（占33.33%）同时具有产IAA、铁载体及解磷、解钾能力。【结论】螃蟹脚蕴藏着丰富的微生物资源及具促生活性的菌株,其中短小杆菌属为优势菌属,假单胞菌属菌株SWFU34的促生活性最突出,具有农业应用的潜力。     

5株产ACC脱氨酶细菌的筛选与鉴定

【目的】从西北地区旱地小麦根际土壤中筛选产1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的细菌,为探讨该类细菌在作物上的应用提供理论依据。【方法】通过富集培养,以ACC为惟一氮源进行筛选,从旱地小麦根际土壤中分离产ACC脱氨酶的菌株,并测定其ACC脱氨酶活性。对筛选所获菌株的菌落形态进行观察,并结合生理生化指标和利用16SrDNA构建的系统发育树对分离的菌株进行鉴定。对筛选菌株的潜在促生能力(包括产3-吲哚乙酸(IAA)、铁载体的能力和溶解无机磷的能力)进行了分析。【结果】共分离出5株产ACC脱氨酶菌株,将其分别命名为BL、CL1、CL2、DL和DS;BL、CL1、CL2、DL和DS产生ACC脱氨酶的活性均较高,分别为0.028,0.065,0.068,0.077和0.018U/mg;结合菌落形态、生理生化特征和构建的系统发育树,鉴定BL和DL为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae),CL1为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),CL2为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii),DS为非脱羧勒克氏菌(Leclercia adecarboxylata)。5株细菌均能产生一定量的IAA和铁载体,且都具有溶解无机磷的能力。【结论】从旱地小麦根际土壤中分离鉴定出5株产ACC脱氨酶活性较高的细菌,且分离的细菌都具有较高的促生潜力。     

具有ACC脱氨酶活性的红枣根际促生菌株的分离筛选及其促生效果研究

采用定向富集法从红枣根际土壤分离筛选具有ACC脱氨酶活性的细菌,同时检测其产生长素(IAA)、固氮和解磷等促生特性。结合形态特征和16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,并采用盆栽试验验证3株高效产ACC脱氨酶的根际促生菌株Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida和Serratia plymuthica对红枣植株生长的影响。结果表明:1)从红枣根际共分离出10株产ACC脱氨酶的菌株,其ACC脱氨酶活性在14.23～433.05μmol/(mg·h)。这些菌株都具有产IAA、固氮和解无机磷能力。2)经鉴定,10株菌株分别属于假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和沙雷氏菌属(Serratia)。3)接种Pseudomonas putida菌剂和Serratia plymuthica菌剂均可显著促进红枣植株生长发育,提高植株株高、生物量、叶片氮及磷含量。2种菌株的接种效应明显优于Pseudomonas fluorescens菌剂,且复合菌株应用促生效果优于单一菌株。     

耐盐菌株的筛选及其促生作用研究

利用1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)为唯一氮源,从辽宁省营口沿海产业基地的?根际盐碱土中,快速筛选出了82株具有ACC脱氨酶活性的菌落.其中7株的ACC脱氨酶活性较高,初步的耐盐检测发现洛菌株在6%盐浓度的TSB培养基中仍可生长,并且菌株对草籽生长有一定的促生作用.其中菌株GPI和GP2的促生作用最为显著,根系长度分别比对照提高29%和28%,且GP1和GP2的ACC脱氨酶比活力分别比作为对照的枯草芽孢杆菌的酶比活力提高了867%和719%.     

高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性

 【目的】筛选高效固氮芽孢杆菌,研究固氮微生物固氮酶活性、竞争适应能力与接种固氮效能的关系,探讨接种固氮芽孢杆菌对根际细菌多样性的影响。【方法】采用无氮培养基富集、加热筛选固氮芽孢杆菌。乙炔还原法测定固氮酶活性,采用盆栽小白菜选育高效固氮芽孢杆菌、研究菌种竞争适应能力与接种固氮效能。通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种。【结果】筛选到了3株固氮酶活性相对较高、固氮能力较强的菌株GD062、GD082和GD282,初步鉴定为芽孢杆菌Bacillus spp.和类芽孢杆菌Paenibacillus sp.。进一步的研究结果表明菌株GD082竞争适应能力较强,在盆栽试验自然土壤条件下接种固氮效能与施用化肥试验处理效果相当,可望进一步研发用于生产固氮微生物肥料。试验结果同时显示,供试菌株的固氮酶活性与其接种固氮效能并不直接相关,菌株的竞争适应能力对接种固氮效能影响很大,接种固氮芽孢杆菌使小白菜根际土壤细菌多样性显著增加。【结论】接种固氮微生物为农作物提供氮素养分具有生产实践意义。高效固氮菌种的筛选是一个复杂的过程,菌株的固氮酶活性与其接种固氮效能并不直接相关,竞争适应能力对接种固氮效能影响很大。筛选到的芽孢杆菌GD082固氮酶活性较高、固氮能力较强、竞争适应能力很强,可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产用菌种。     

阿尔山白桦根际土壤固氮菌多样性及特性

采用阿须贝无氮培养基分离纯化白桦(Betula platyphylla)根际土壤固氮菌,根据菌落形态、16S rDNA序列分析及生理生化特性进行固氮菌的鉴定,从而探讨阿尔山国家森林公园自然保护区白桦根际土壤固氮菌的多样性,并对典型固氮菌进行pH、温度和解磷能力的测定。结果表明:分离出的31株固氮菌分属于Pseudomonas、Variovorax、Burkholderia、Rhizobium、Paenibacillus、Arthrobacter、Rhodococcus、Bosea、Labrys、Phyllobacterium、Mesorhizobium、Mucilaginibacter 12个不同的类群。不同类群的固氮菌pH和温度生长范围有所不同;分离得到的典型固氮菌中,有3株具有解磷活性。     

3株联合固氮菌对甘蔗的促生作用

【目的】探讨3株联合固氮菌单株或组合接种对甘蔗组培苗的促生效应。【方法】采用室内盆栽试验,分别设单菌株（11-31, 07-98和08-200）及其4个不同菌株组合共7个接菌处理接种新台糖22号（ROC22）组培苗,设1个不接菌处理为对照,接种86 d后比较不同处理对甘蔗生物量、株高、氮磷含量和根系活力等生理生化性状的影响。【结果】7个接菌处理对甘蔗植株的生物量、株高、氮磷含量和根系活力等生理生化性状均有不同程度的提高,其中处理Ⅶ的促生效应最为显著,该处理的植株株高和生物量分别比对照增长25.23%和60.79%;植株总氮含量最高的是处理Ⅳ,比对照增长45.79%;含磷量增长最显著的是处理Ⅶ,比对照增长76.29%。【结论】联合固氮菌单株或组合接种对甘蔗生长、氮磷元素的累积和生理生化性状都有不同程度的促进作用,但不同处理对甘蔗的促生效应有显著差异;多菌株混合接种的促生效应不一定会比单菌株接种高,具体效果因固氮菌种类和组合而异。     

延长油田增油细菌的筛选及其降解特性研究

【目的】分离筛选可提高原油采收率的增油细菌。【方法】以原油为唯一碳源,利用富集培养和稀释平板法从延长油田油污土壤中分离增油菌株;通过排油能力测定、原油附着与乳化性能观察、代谢产物表面活性物质分析及原油降解试验,从分离的菌株中筛选增油性能较好的细菌菌株,并通过菌落形态观察、生理生化特性测定及16S rDNA全序列分析,对筛选的排油及乳化性能较好的细菌进行鉴定。【结果】①从原油及油污土壤中筛选出25株细菌,从中选择10株代谢产物中含有表面活性成分脂肽或糖脂的优势细菌用于后续试验,该10株菌均可导致原油物理化学性质发生变化,提高原油在油水发酵液中的乳化度,同时降低原油对瓶壁的附着度。②4株乳化及排油效果较好的菌株6-1、P₁H₁₃₂、AP₁H₁₁和6-3Y对原油的降解效果较好,与原油作用后,原油组分中有34.0%～55.3%的组分被细菌完全降解而消失。③4株细菌的鉴定结果为：6-1为Rhizobium pusense,P₁H₁₃₂为Zhihengliuella aestuarii,AP₁H₁₁为Bacillus licheniformis,6-3Y为B.aryabhattai。【结论】获得的10株增油细菌具有良好的增油潜力,其中已鉴定的4株细菌可用于进一步的增油试验,在微生物采油和原油污染处理方面具有应用潜力。     

3株联合固氮菌对甘蔗的促生作用

【目的】探讨3株联合固氮菌单株或组合接种对甘蔗组培苗的促生效应。【方法】采用室内盆栽试验,分别设单菌株（11-31, 07-98和08-200）及其4个不同菌株组合共7个接菌处理接种新台糖22号（ROC22）组培苗,设1个不接菌处理为对照,接种86 d后比较不同处理对甘蔗生物量、株高、氮磷含量和根系活力等生理生化性状的影响。【结果】7个接菌处理对甘蔗植株的生物量、株高、氮磷含量和根系活力等生理生化性状均有不同程度的提高,其中处理Ⅶ的促生效应最为显著,该处理的植株株高和生物量分别比对照增长25.23%和60.79%;植株总氮含量最高的是处理Ⅳ,比对照增长45.79%;含磷量增长最显著的是处理Ⅶ,比对照增长76.29%。【结论】联合固氮菌单株或组合接种对甘蔗生长、氮磷元素的累积和生理生化性状都有不同程度的促进作用,但不同处理对甘蔗的促生效应有显著差异;多菌株混合接种的促生效应不一定会比单菌株接种高,具体效果因固氮菌种类和组合而异。