成年昆明小鼠雄性生殖干细胞的分离培养及其多能性研究

【目的】从成年昆明小鼠睾丸组织中分离具有多能性的雄性生殖干细胞(Male germline stem cells,mGSCs)。【方法】采用机械法和2步酶消化法分离出成年昆明小鼠的精原细胞,经差速贴壁后,培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,2周后得到类胚胎干细胞(ESCs)样mGSCs。对得到的mGSCs进行碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、RT-PCR、体内分化等检测。【结果】mGSCs具有类似ESCs的形态和多能性,AP染色呈阳性,免疫荧光Oct4、Vasa染色呈阳性,RT-PCR检测其表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因和Vasa、C-kit等生殖细胞的标记基因,在免疫缺陷鼠体内能形成畸胎瘤,组织学检测其可形成包括3个胚层在内的多种类型细胞。【结论】从成年昆明小鼠睾丸分离的精原细胞,在体外培养去分化形成了具有类ESCs生物学特性的mGSCs,mGSCs既具有多能性,也具有生殖细胞的基本生物学特性。     

鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性

为研究鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞生物学特性,取30～50日龄鲁西黄牛胚胎四肢骨骼肌,分离培养鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞.结果显示,试验成功地分离了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞,原代培养并传代至16代,免疫细胞化学染色检测卫星细胞表面特异性标志Desmin、MyoD呈阳性表达,RT-PCR检测Desm in、c-Met、Myf5、pax7呈阳性表达;绘制生长曲线,结果说明细胞具有较强增殖能力;应用流式细胞仪对细胞进行周期分析,结果显示S期细胞所占比例为8.94％;骨骼肌卫星细胞向成肌细胞诱导10 d后,免疫细胞化学染色检测成肌特异性标志骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达;骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞诱导7d后,油红O染色呈阳性,RT-PCR检测脂肪细胞特异性标志pparγ、LPL呈阳性表达.结果表明试验成功建立了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞的体外扩增培养体系,且该骨骼肌卫星细胞有发育形成肌管和脂肪细胞的多项分化潜能.     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P0.01);CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著(P0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

绵羊成肌细胞的纯化、培养、鉴定及其成肌诱导分化研究

为建立绵羊成肌细胞体外纯化、培养和鉴定的方法以及对成肌细胞进行成肌诱导分化的初步研究,本试验以绵羊胎儿为材料,采用胶原蛋白酶ⅠA消化分离成肌细胞,分别用Percoll分离液梯度离心和2次差速贴壁法纯化成肌细胞,采用免疫荧光方法检测成肌细胞的特异性标志蛋白Desmin以及RT-PCR鉴定成肌细胞的定型因子Myf5和MyoD1。细胞传至第二代后用CCK-8试剂盒检测细胞生长曲线。利用含2%马血清的培养基进行分化诱导并进行MYH1(Myosin heavy chain 1肌球蛋白重链1)免疫荧光染色。结果显示,梯度离心和差速贴壁法均可获得较高纯度的成肌细胞,纯度均在92%以上。RT-PCR结果显示细胞高表达Myf5和MyoD1。细胞符合正常生长规律,生长曲线近似S形。对成肌细胞进行诱导分化,大部分细胞融合为肌管,成肌特异性标志MYH1表达呈阳性。本研究获得了绵羊成肌细胞分离纯化培养及鉴定的方法、高纯度的绵羊成肌细胞系,为以后利用成肌细胞研究肌肉发育调控机理提供了材料。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

鸽骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

为建立鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定方法,以高邮鸭13胚龄的胸肌和腿肌为材料,采用混合酶消化法和差速贴壁法分离纯化骨骼肌卫星细胞,用特异性标志Pax7对纯化细胞进行免疫荧光鉴定.结果表明胸肌和腿肌都能成功获取骨骼肌卫星细胞,细胞增殖旺盛,分化良好;纯化后的细胞免疫荧光鉴定阳性率达95％.表明该技术能成功分离和鉴定鸭骨骼肌卫星细胞,为以后骨骼肌卫星细胞相关研究提供了技术平台.     

翘嘴红鲌精原干细胞的分离培养及鉴定

通过制作、观察翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)各生长阶段的精巢切片,确定翘嘴红鲌精原干细胞最佳分离时间。采用两步酶消化法分离其精原干细胞,并进行体外初步培养研究,最后通过碱性磷酸酶染色、干细胞标志基因Oct-4 RT-PCR扩增进行鉴定。结果显示:7月龄翘嘴红鲌精巢为分离精原干细胞的最佳时期,所分离的精原干细胞符合干细胞的形态、增殖及表达特征,且细胞碱性磷酸酶染色呈阳性,支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性,Oct-4基因表达呈阳性。     

鹅成肌细胞的体外培养、鉴定及温度对细胞增殖分化的影响

骨骼肌的生长发育与动物生长性状有很强的关联性,建立鹅成肌细胞培养方法对于鹅骨骼肌生长发育的研究具有重要意义.本研究使用马岗鹅胚胎期15 d左右的胸腿肌组织,通过胰蛋白酶消化法分离细胞,差速贴壁法纯化成肌细胞;通过对成肌细胞分化决定因子Myog和成熟肌管标志基因Myh1的表达量进行检测,并结合肌管标志蛋白MyHC免疫荧光染色对分离纯化并诱导分化的成肌细胞进行鉴定.本研究发现腿肌成肌细胞增殖分化能力显著高于胸肌,成肌细胞在39℃培养温度下增殖分化能力高于37℃.本研究成功建立了马岗鹅胚成肌细胞系,对后续进行鹅骨骼肌发育调控机理研究具有重要意义.     

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1-3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%-80%时,将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin,WM）的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）,而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基（proteasome subunit beta type-5, PSMB5）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting 法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNA si-RNA-PSMB5（si-PSMB5）,构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）,采用（Lipofectamine）3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期（P<0.05）。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。     

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。     

安淮山羊骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

为了分离得到安淮山羊骨骼肌卫星细胞,成功构建山羊骨骼肌卫星细胞系,为相关研究提供实验材料。以安淮山羊背最长肌肌肉组织为材料,采取胶原酶和胰蛋白酶结合的二步消化法,结合差速贴壁法纯化原代骨骼肌卫星细胞。对骨骼肌卫星细胞中特异性基因Pax7用免疫荧光染色法及PCR扩增加以鉴定。通过分离、纯化,得到纯度较高的山羊骨骼肌卫星细胞,其形态为圆形,折光性强。培养一段时间后密度增大,细胞呈梭型。所得骨骼肌卫星细胞生长状态良好,具有较为一致的生长方式和形态特点。经免疫荧光染色法以及PCR鉴定发现细胞系中有Pax7基因的表达。通过上述材料和方法,可获得较纯的山羊骨骼肌卫星细胞,并稳定传代。     

转卵泡抑制素基因对绵羊肌源性细胞中 肌肉抑制素基因的调控

【目的】构建骨骼肌特异表达目的基因卵泡抑制素（follistatin,FST）的真核表达载体pCFCDs-red和 pSPFCDs-red,分别转染到不同细胞系中,检测FST及下游基因在RNA和蛋白水平的表达情况,同时测定骨骼肌特异启动子SP和α-actin的启动效率,以研究FST的特异表达对肌肉发育的影响。【方法】利用脂质体分别将真核表达载体pCFCDs-red和pSPFCDs-red转染到绵羊胎儿成纤维细胞（SFFCs）、骨骼肌卫星细胞（SMSCs）和SMSCs诱导肌管中,获得转基因细胞;对获得细胞的生长状况、细胞周期、细胞形态大小以及目的基因和下游基因的表达情况,分别用流式细胞仪、实时定量PCR和western blotting等方法进行检测分析。【结果】①转基因细胞系的生长趋势与非转基因细胞相似,转基因SMSCs细胞增殖的速度高于转基因SFFCs细胞;②流式细胞仪分析表明,转基因细胞系转染后70%以上细胞均处于G0/G1期,保持旺盛的分裂能力、具有单一峰值、细胞的整倍性好、细胞电子体积显著增大;③实时定量PCR及western blotting检测结果表明,转基因细胞系中FST的RNA及蛋白水平相比非转基因细胞系均上调;④转基因SMSCs和肌管相比转基因SFFCs细胞的FST表达量高,转pSPFCDs-red转基因细胞中FST的表达水平比转pCFCDs-red细胞系高。【结论】骨骼肌特异性启动子SP及α-actin能够在SMSCs及肌管中有效启动FST目的基因的表达,且在肌管中具有较高的表达量,SP启动子的启动效率较高于α-actin。在肌源性细胞中,FST的上调可以引起MSTN蛋白水平的下调,FST对骨骼肌细胞的生长发育具有一定促进作用。     

牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。     

褪黑素和烟酰胺单核苷酸对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的影响

【背景】目前关于褪黑素（melatonin,MLT）的研究多集中在家禽的生殖功能上,而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关,研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限,而共同处理的效果更为显著,虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道,但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制,为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞,并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞,在体外成熟培养基础上用1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN分别单独或组合处理细胞24 h后,利用CCK-8检测细胞活力;为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制,通过构建MLT受体基因（MTNR1A、MTNR1B）的过表达载体,并与1 ng·mL-1 MLT共同处理细胞,采用qRT-PCR和Western b...