转基因抗虫棉叶围卡那霉素抗性细菌种群动态及nptⅡ基因漂移研究

 【目的】研究转基因抗虫棉叶围卡那霉素抗性细菌的种群动态变化，并监测nptⅡ基因向叶围细菌漂移的情况。【方法】采用常规培养的方法分析转基因抗虫棉33B、SGK321和GK12、受体棉33、石远321和泗棉3号叶围具有卡那霉素抗性的细菌在整个生育期的种群动态变化，并以质粒pBI121为对照，根据nptⅡ基因设计特异性引物，采用菌落PCR方法对分离的叶围卡那霉素抗性细菌进行nptⅡ基因漂移监测。【结果】6个棉花品种的叶围卡那霉素抗性细菌总数量和群落多样性指数随着时间的变化，在同一棉花品种不同采样时间之间差异显著，而同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间多数差异不显著。在转基因抗虫棉品种SKG321，GK12及受体棉泗棉3号的叶围细菌中发现阳性片段。【结论】叶围卡那霉素抗性细菌的总数量及群落多样性指数在抗虫棉与对应的受体棉之间多数差异不显著。转基因抗虫棉中的nptⅡ基因可能向叶围细菌漂移。     

转基因抗虫棉叶围细菌种群动态变化及其分子鉴定

 【目的】研究转基因抗虫棉叶围细菌的种群动态变化，并鉴定主要的细菌种群。【方法】采用常规培养的方法与RISA法相结合，分析转基因抗虫棉花33B、SGK321和GK12、受体棉花33、石远321和泗棉3号的叶围细菌在整个生育期的种群动态变化，并对主要细菌种群的ITS序列进行克隆测序，与数据库的序列进行比对鉴定细菌。【结果】6个棉花品种的叶围细菌的数量和群落多样性指数随着时间的变化，同一棉花品种不同采样时间之间差异显著，而同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间的差异较小。用RISA法分析棉花叶围细菌群落结构，能够得到清晰的指纹图谱，图谱表明叶围细菌群落结构复杂，多样性丰富，聚类分析结果表明，叶围细菌群落变化与棉花品种无相关性。从棉花叶围分离了104类菌株，对14个主要菌株进行分子鉴定，14个菌株的ITS序列都被GenBank收录（登陆号为DQ447751-DQ447764）。【结论】叶围细菌的总数量及群落多样性指数在抗虫棉与对应的受体棉之间多数差异不显著。棉花叶围细菌主要涉及9个细菌属，占优势的为芽孢杆菌属（Bacillus）、假单孢菌属（Pseudomonas）。     

新疆Bt棉田根际土壤微生物群落变化研究

【目的】通过分离Bt棉和常规棉根际土壤微生物,研究Bt棉对根际土壤微生物的种群影响。【方法】在2011²012年间,采用平板计数法、稀释培养法和MPN(most probable number)法分析Bt棉中棉所41号和常规棉中棉所49号根际根际土壤微生物真菌、细菌和放线菌以及细菌功能类群在整个棉花生育期的数值变化。【结果】不同年度间,随着棉花发育期的推进,Bt棉和常规棉根际土壤中的真菌、放线菌、细菌和细菌不同功能类群的数量变化趋势基本一致,逐渐上升或下降,在棉花发育后期数量达到最大。不同棉花发育时期和不同品种间,Bt棉和常规棉根际土壤中的真菌、放线菌、细菌,包括不同细菌功能类群变化有明显差异,但无明显规律性,集中体现在蕾期、花铃期和吐絮期。Bt棉和常规棉根际土壤细菌功能类群的多样性指数、优势集中性指数和均匀度指数在5个棉花发育时期变化趋势基本一致,不同棉花发育时期,花铃期的各项特征参数最低,吐絮期最高;不同品种间,在苗期、蕾期、花铃期和收获期,Bt棉的数值高于常规棉,但无明显差异;在吐絮期则有明显差异,2011年和2012年各项特征参数结果相反。【结论】Bt棉和常规棉根际土壤微生物群落变化主要受到棉花发育期、棉花品种和年度季节交替的影响,短期内尚未发现Bt毒蛋白能够引起土壤根际微生物群落的变化。     

转Bt Cry1Ac基因抗虫棉花外源基因漂移研究

【目的】研究转Bt Cry1Ac基因棉花外源基因漂移规律,为转基因棉花生态安全性评价提供依据。【方法】2014年在吐鲁番市和2015年在库尔勒市,利用小区试验种植转基因棉花,翌年利用卡那霉素抗性检测结合分子检测的方法检测外源基因的漂移。【结果】在距离转基因棉花小区边缘1~120 m均能检测到含有外源基因Cry1Ac。SGK321种子漂移率最大漂移率是向南方向距离转基因棉花小区边缘1 m处,漂移率为5%;GK19最大漂移率是向西方向达到了10.09%。以方向因素和距离因素建立Cry1Ac基因漂移Logistic回归预测模型,方向和距离对种子漂移都有显著影响(P0.05),但方向和距离两个因子并不能最终决定外源基因的漂移率。【结论】转基因棉花外源基因漂移率受方向和距离的影响,但最终决定外源基因的漂移率,并不是方向和距离联合作用的结果。     

不同黄萎病抗性棉花品种对土壤微生物数量的影响

【目的】阐明棉花不同抗性品种与土壤微生物群落的关系,为棉花抗黄萎病机理和防治措施提供理论依据。【方法】选取5种不同抗性棉花品种在根盒中进行培养,对根际和距根际不同距离土壤中真菌、放线菌和细菌进行平板计数。【结果】健康土壤培养抗病棉花品种根系对土壤中细菌和放线菌有聚集作用,对真菌有一定的排斥作用;耐病和感病品种则相反。接入拮抗菌和施微生物有机肥能够增加细菌和放线菌数量,降低真菌的比例。【结论】土壤微生物数量及比例与棉花抗性存在密切相关性。     

转ScMV-CP基因甘蔗对根际土壤酶活性及微生物的影响

【:研究目的】转ScMV-CP基因甘蔗对根际土壤酶活性和微生物的影响。【方法】利用BIOLOG EcoplateTM微平板(BIOLOG Inc.,USA)结合微生物的平板培养及相关的土壤酶活性分析【。结果】结果表明:转基因甘蔗显著(p<0.05)降低了土壤脱氢酶的活性,提高了土壤的纤维素酶、蛋白酶和脲酶活性(p<0.01),而对蔗糖酶和磷酸单脂酶没有影响;转基因甘蔗显著增加了根际土壤可培养的细菌和真菌数量(CFUs),但对放线菌影响很小。转基因甘蔗并没有增加土壤中对卡那抗性的微生物数量(CFUs);BIOLOGEcoplate研究表明转基因甘蔗稍微提高了根际土壤细菌的代谢活力,细菌多样性分析表明,根际土壤细菌的Simpson指数(D’)、Shannon-Wiener指数(H’)、细菌生理群分布的均匀度、Mclntosh指数(DMc)差异不明显【。结论】转基因甘蔗对根际土壤酶和土壤微生物有一定影响,但没有增加对卡那抗性的微生物数量(CFUs);BIOLOG实验未发现转基因甘蔗对土壤细菌的多样性有影响。     

西瓜枯萎病抗性及其嫁接对根际土壤微生物数量及群落结构的影响

 【目的】揭示不同枯萎病抗性西瓜品种根际土壤微生物的差异及嫁接提高抗病性的土壤微生物学基础。【方法】以抗枯萎病西瓜品种‘甜妞’和感枯萎病西瓜品种‘天使’为试材，以南瓜（博强1号）为嫁接砧木，采用平板计数及PCR-DGGE技术，研究抗感枯萎病西瓜品种自根苗、嫁接苗和砧木不同生育期根际土壤微生物数量及群落结构的变化。【结果】抗性品种根际土壤细菌数量在生育期的中后期显著高于感病品种，根际土壤真菌数量显著低于感病品种；感病品种嫁接后根际土壤细菌和放线菌数量均高于非嫁接处理，而镰孢菌除苗期外均低于非嫁接处理；PCR-DGGE结果表明，不同处理根际土壤细菌、真菌群落结构存在差异，且随生育期的变化而变化。对差异条带测序分析说明不同西瓜品种及嫁接砧木南瓜根际分布不同的细菌和真菌群。【结论】西瓜抗病品种的根际土壤细菌和放线菌的数量显著高于感病品种，而真菌和镰孢菌数量显著低于感病品种，品种的抗性与根际土壤微生物的种群和数量密切相关；嫁接提高了感病品种根际土壤细菌、放线菌微生物数量，抑制了枯萎病菌的积聚，改变了根际土壤微生物群落结构。植物基因型对根际土壤微生物群落结构有显著影响，而根际微生物群落结构的不同将导致植物对病原菌的抗性差异及品种差异。     

玉米根际土壤微生物群落结构及多样性季节变化特征

【目的】研究玉米根际与非根际土壤微生物群落结构及多样性季节变化特征。【方法】利用Illumina-MiSeq高通量测序技术对不同季节玉米根际与非根际土壤中细菌的16S rDNA基因V3～V4区片段和真菌18S rDNA基因V4区片段进行了测序。【结果】①不同季节玉米根际与非根际土壤理化性质随季节变化趋势一致,玉米根际、非根际土壤电导率随季节呈先增加后降低趋势,大致表现为夏季秋季春季冬季,不同季节玉米根际土壤电导率均显著高于非根际(P0.05);由春季到冬季,玉米根际、非根际pH值呈先降低后增加趋势,大致表现为春季冬季秋季夏季,不同季节玉米根际土壤电导率均显著低于非根际(P0.05)。②不同季节玉米根际与非根际土壤养分含量(有机碳、全氮和全钾)随季节变化趋势相一致,由春季到冬季,玉米根际、非根际养分含量均呈先增加后降低趋势,以夏季玉米根际、非根际土壤养分含量最高,冬季玉米根际、非根际土壤养分含量最低,并有所波动。③不同季节玉米根际与非根际土壤细菌和真菌覆盖度、丰富度指数、Shannon-Wiener指数、均匀度Evenness、ACE、Chao 1指数、Simpson指数随季节变化趋势相一致,由春季到冬季,根际、非根际土壤细菌和真菌多样性指数均呈先增加后降低趋势,并且不同季节根际土壤细菌和真菌多样性指数均显著高于非根际。④玉米根际和非根际土壤细菌群落中,优势类群主要是变形菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门,还包括浮霉菌门、放线菌门、拟杆菌门、后壁菌门、绿弯菌门、疣微菌门,其中根际土壤细菌酸杆菌门相对丰度高于非根际,变形菌门相对丰度低于非根际。根际和非根际土壤真菌群落中,优势类群主要是子囊菌门和担子菌门,还包括结合菌门、壶菌门、新丽鞭毛菌门、球囊菌门、芽枝菌门。⑤相关性分析表明:玉米土壤细菌和真菌Coverage、ACE与土壤养分均没有显著的相关性(P0.05);土壤pH与土壤细菌和真菌多样性呈负相关,土壤电导率和全磷与土壤细菌和真菌多样性均没有显著的相关性(P0.05)。【结论】玉米土壤根际和非根际细菌和真菌群落具有很好的相似性,并且根际和非根际细菌群落产生明显的分离效应。     

黄瓜连作对土壤微生物区系影响Ⅱ——基于DGGE方法对微生物种群的变化分析

 【目的】研究黄瓜连作土壤微生物群落演替规律。【方法】采用PCR-DGGE技术分析不同种植茬次黄瓜根区土壤微生物群落的动态变化。【结果】黄瓜连作引起土壤中细菌种群发生较大变化，其中Bacteriovorax sp.（序列同源性为93%）、Pseudomonas sp.(序列同源性达97%)和另两种未培养（Uncultured）细菌种群数量减少，而Sphingomonas sp.（序列同源性达100%）和另一未培养细菌种群数量增加。连作对土壤真核微生物影响较小，但其在根际的数量变化幅度较非根际明显。【结论】黄瓜根际细菌数量与其生长发育关系密切，而非根际细菌数量随黄瓜生长发育变化不大。黄瓜连作导致根际微生物数量显著变化可能与根分泌物在根部累积有关。     

转基因抗虫棉农艺性状及光合特性

以转基因抗虫棉中棉所41、SGK321、郑199和其相应的受体品种中棉所23、石远321、中棉所12为试验材料,研究抗虫基因导入对棉花生长发育的影响。结果表明,转基因抗虫棉株高低于其受体品种,单株结铃数、成铃率高于其受体品种,铃质量、衣分低于其受体品种。抗虫基因导入引起的结铃性增强效应与铃质量、衣分减弱效应相平衡,使得转基因抗虫棉的皮棉产量与其受体品种基本持平。转基因抗虫棉的光合强度和叶绿素含量在7月8日以前低于其受体品种;7月8日-7月26日高于其受体品种;7月26日以后递减速率高于其受体品种。     

棉花与几种作物根际土壤酶活性及细菌多样性分析

【目的】 研究种植不同抗病性棉花以及不同经济作物对根际土壤酶活性以及细菌多样性影响,为棉田土壤微生态调控技术提供依据。【方法】 利用土壤酶检测试剂盒及高通量测序技术,检测分析不同抗病性棉花及种作物根际土壤酶活性及细菌多样性。【结果】 不同抗病性棉花根际土壤过氧化氢酶、脱氢酶、脲酶活性均没有显著差异,5与7月2个采样时期之间无显著差异;棉花与水稻间作处理过氧化氢酶、脱氢酶和脲酶分别较棉花单作升高3.84%、28.7%、45.2%,水稻处理较棉花单作升高8.87%、102.4%、80.4%,间作对土壤酶活性表现出提升作用,但未达到显著水平;苜蓿、大豆、花生3种豆科作物根际土壤酶活性普遍高于甜菜、番茄和玉米,但是未达到显著差异。耐病品种新陆中66号与感病品种军棉1号根际土壤的细菌OTU数量和α多样性指数均无显著差异。大豆、花生、苜蓿3种豆科作物根际土壤细菌的OTU数量和Ace、Chao1指数均高于棉花,番茄、玉米、甜菜3种作物根际土壤细菌OTU数量和α多样性指数均低于棉花,其中大豆的增幅较大,甜菜降幅较大,但是不同作物之间未达到显著性差异。【结论】 单季生育期内,种植不同抗病性棉花品种和不同作物、棉花-水稻间作等均未对根际土壤酶活性、细菌数量和多样性造成显著影响,棉花与不同作物搭配、间作等模式改变棉田土壤的微生态环境可能需要较长的生长周期。     

新疆棉花根际土壤铁载体产生菌的遗传多样性及系统发育研究

 【目的】了解中国新疆地区铁载体产生菌的遗传多样性和系统发育，为筛选高效铁载体产生菌提供依据。【方法】采用BOXAIR-PCR、16S rRNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析方法对分离自新疆地区棉花根际土壤的铁载体产生菌的遗传多样性进行分析。【结果】在BOXAIR-PCR分析中，68株供试菌分为11个遗传群;在16S rRNA PCR-RFLP分析中，68株供试菌分10个遗传群;代表菌株的16S rDNA 全序列分析表明，供试菌分属于假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动细菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、短状杆菌属（Brachybacterium）和泛菌属（Pantoea）。其中，假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属。【结论】分离自新疆地区棉花根际土壤铁载体菌存在极大的遗传多样性。     

施用生物菌剂对棉田土壤细菌群落多样性及种群结构的影响

目的 研究生物菌剂对棉田土壤细菌群落多样性及种群结构的影响,分析生物菌剂对新疆棉田土壤微生态的改善效应,为提高棉花土传病害的生物防治与化肥减施技术提供依据。方法 采集施用生物菌剂及对照棉田10~20 cm土壤,检测土壤理化性质并利用Illumina Hiseq 2500 PE250高通量测序平台分析土壤细菌多样性。结果 施用生物菌剂且停施头水肥后,土壤中全氮、有机质、速效钾含量分别下降28.7%、27.5%和31.9%,全磷、速效氮含量没有下降,全钾含量变化不大。施用生物菌剂后土壤中细菌的ACE、Chaol、Shannon指数与对照相比均无显著差异,与常规管理棉田相比停施头水肥后土壤细菌的ACE、Chaol丰富度指数显著降低。施用生物菌剂与对照相比能够影响土壤微生物群落组成,在减施化肥的情况下影响程度降低。施用生物菌剂且停施头水肥与常规管理棉田的土壤细菌种群之间没有显著差异标记。生物菌剂处理中芽孢杆菌属的丰度均高于对照,呈现出逐年增加的趋势,而假单胞菌属的丰度在生物菌剂处理中均低于对照,溶杆菌属、链霉菌属的丰度在不同处理中无一致规律。结论 棉田停施头水肥显著降低了土壤细菌的丰度,施用生物菌剂未对棉田土壤细菌的多样性和种群结构造成显著影响,增加了棉田土壤中有益细菌芽孢杆菌属的丰度。在新疆棉花耕作系统中,持续施用生物菌剂以形成作物根际微生物保护层,维持作物根际的健康。     

不同种植地苜蓿根际土壤细菌群落结构多样性差异分析

【目的】研究新疆北部不同种植地苜蓿根际细菌群落结构多样性与生态功能,分析土壤酶活性对苜蓿根际细菌群落结构的影响,为新疆苜蓿土壤微生物的分布特征提供基础数据。【方法】使用高通量测序技术对新疆北部不同种植地苜蓿根际与非根际土壤细菌群落结构多样性进行研究,比较根际与非根际土壤细菌群落结构多样性差异及与土壤酶活性之间的关系;利用Tax4Fun功能预测获得相应样地的细菌群落的生态功能。【结果】新疆北部不同种植地苜蓿根际土壤酶活性大体表现为根际大于非根际,根际微生物在提高土壤酶活性中具有重要指示作用。Alpha多样性指数与土壤中性磷酸酶之间呈显著正相关性(P<0.05)而与其他土壤酶活性之间无显著性关系,细菌群落结构特征与土壤中性磷酸酶含量具有很强的相关性。利用高通量测序技术对苜蓿根际、非根际土壤中微生物进行测序,所有2581720条序列分属于细菌的51个门、64个纲、137目、252科和600属;所有土壤样品中在门水平上,变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)丰度最高;在属水平上其中12个土样类型共同拥有的有190个属。 Tax4Fun基于SILVA数据库进行基因功能预测,苜蓿根际细菌群落所涵盖的一级功能基因为:环境信息处理(Environmental_Information_Processing)、未分类(Unclassified)、生物体系统(Organismal_Systems)、人类疾病(Human_Diseases)、新陈代谢(Metabolism)、遗传信息处理(Genetic_Information_Processing)、细胞过程(Cellular_Processes)。【结论】新疆北部不同种植地苜蓿根际土壤细菌多样性改变与土壤中性磷酸酶含量有关,根际与非根际及不同种植地之间,微生物群落组成相似,但物种多样性、细菌的生态功能存在一定差异。     

生防菌在棉田土壤中定殖数量与防病作用相关性

【目的】研究拮抗菌施入棉田土壤后生防菌的数量变化和棉花黄萎病的发病情况，分析生防菌的定殖与防病的相互关系，为生防细菌在棉花黄萎病的防治应用提供理论依据。【方法】选择4株棉花内生和根际拮抗菌Bacillus atrophaeus SHZ-24、Bacillus vanillea SMT-24、Bacillu subtilis SHT-15和Bacillus velezensis BHZ-29进行盆栽试验，使用平板计数和实时荧光定量分析细菌和病原菌。【结果】4株拮抗细菌在土壤中数量变化趋势相同，50 d时的存活量从高到低分别为SHZ-24、BHZ-29、SMT-24、SHT-15,4株拮抗细菌处理均可降低棉苗的病情指数。【结论】BHZ-29的防病效果较好。4株拮抗细菌在土壤中的定殖数量与防病效果呈显著正相关。     

盐穗木叶片及根际土壤微生物群落高通量分析

【目的】 研究新疆盐碱环境中,极端耐盐植物盐穗木的根际土壤及叶片内生微生物群落组成和结构,为利用根际促生细菌制作生物菌肥提供科学依据。【方法】 应用16S rDNA和ITS高通量测序技术,测定分析盐穗木根际土壤与叶片内生微生物群落结构及多样性。【结果】 在门水平上根际土壤细菌群落中的优势菌门为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)等。根际盐穗木真菌群落中的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)。在门水平下,盐穗木叶片内生细菌群落中的优势菌门为蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria);内生真菌群落中的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)。Alpha 多样性指数分析得出,在3 个土壤样品中,YS1的Shannon,Simpson指数最高,即微生物群落多样性较其余2个样品高。【结论】 在3个叶片样品中,YP3的Shannon,Simpson等指数最高,即微生物群落多样性较其余2个样品高。盐穗木根际土壤微生物群落多样性高于叶片内生微生物群多样性。     

Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的表达

【目的】评价转基因抗虫棉的生物安全性。【方法】利用3个由花粉管通道法获得的转Bt基因的抗虫棉品系,通过Southern杂交技术研究了抗虫棉的插入数,通过棉铃虫饲喂、半定量RT-PCR和ELISA测定了抗虫棉的Bt杀虫活性的时间和空间的动态变化。【结果】Bt基因在抗虫棉中为1~2个拷贝数;Bt蛋白杀虫活性的时空动态表现为在不同生育期的同一器官中,苗期叶片的表达比花铃期的叶片强,在同一生育期内,不同器官表达不同,叶片和铃壳的表达高于苞叶、花和雌雄蕊。【结论】Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的抗性具有时空表达特异性。