三七ISSR-PCR反应体系建立及优化

 为建立和优化三七 ISSR PCR反应体系,运用正交试验和单因子试验分析模板DNA,TaqDNA聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs 5个因子对ISSR PCR反应影响。结果发现,三七 ISSR PCR 25μL反应体系中5个因子最佳水平：DNA模板为9.6ng,TaqDNA聚合酶为2.0u, Primer浓度为1.0mmol/L,dNTPs浓度为0.68mmol/L,Mg2+浓度为2.8mmol/L。研究结果为利用ISSR分子标记技术研究三七提供了理论支持。     

高山杜鹃ISSR-PCR反应体系建立

[目的]建立高山杜鹃的ISSR—PCR反应体系。[方法]运用正交试验分析模板DNA、TaqDNA聚合酶、Primer、Mg^2＋和dNTPs5个因子对杜鹃ISSR-PCR反应影响，建立高山杜鹃ISSR-PCR反应体系。[结果]杜鹃ISSR—PCR25m反应体系中5个因子较适水平为：DNA模板浓度为1．6ng／μl，TaqDNA聚合酶浓度为0．040U／μl，Primer浓度为0．64mmol／L，dNTPs浓度为0．68mmol／L，Mg^2＋浓度为2．08mmol／L。[结论]研究结果为利用ISSR分子标记技术研究杜鹃提供了理论支持。     

蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

一品红ISSR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对一品红ISSR反应的5个因素(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA酶浓度)在4个水平上进行优化试验,通过不同反应体系扩增效果比较,建立了优化的一品红ISSR反应体系:50μL的PCR体系中含有DNA模板100 ng、Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTPs 0.20 mmol·L-1、引物300 pmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0 U.     

假臭草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因子试验、L16(45)正交试验设计,以假臭草DNA为模板,研究了PCR反应体系中的5种主要成分,即Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物及模板,对假臭草ISSR-PCR扩增结果的影响,并对引物退火温度进行了筛选和优化.建立了假臭草ISSR最佳反应体系:在20 μL的反应体系中,Mg2+为2.0 mmol/L,模板DNA用量为60 ng,TaqDNA聚合酶为1.5U,dNTPs浓度为0.2mmol/L,引物浓度为0.3μmol/L.假臭草ISSR反应体系的建立为利用该技术分析假臭草遗传多样性及探索防控措施提供良好的基础.     

宁夏枸杞ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验和单因子梯度优化相结合的方法,建立和优化枸杞稳定的ISSR - PCR的反应体系和扩增程序.结果表明,适用于枸杞的25 μL ISSR - PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:dNTPs 0.25 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,引物0.4μmol/L,模板DNA 50 ng,Taq酶1.0U.对于枸杞ISSR - PCR试验,一次正交试验完全可以建立满足要求的PCR体系.     

褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度等因素对简单重复序列间扩增(ISSR)反应体系进行优化。结果表明,褐苞薯蓣ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1. 875 U,DNA模板量52. 5 ng,d NTPs浓度0. 25 mmol/L,引物浓度0. 437 5μmol/L,Mg~(2+)浓度1. 5 mmol/L,10×Taq Buffer 2. 0μL,其余用dd H_2O补齐。     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2＋、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为：25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2＋2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

黄芪ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为获得最优黄芪ISSR-PCR反应体系,以山西省浑源县官儿乡蒙古黄芪为试验材料,利用单因素试验法对反应体系中的4个因素(模板DNA,dNTPs,Taq DNA聚合酶,ISSR引物)分别设置浓度梯度进行体系优化。结果表明,20μL黄芪ISSR-PCR最优体系为:模板DNA质量浓度6.0 ng/μL,dNTPs浓度0.03 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度0.05 U/μL,引物浓度0.80 mmol/L。最后用不同产地的黄芪检测该体系,结果发现,PCR产物多态性良好。优化体系的确立为今后黄芪种质资源的分子评价奠定了技术基础。     

丝瓜ISSR-PCR反应体系的建立

以丝瓜为试材,研究了ISSR-PCR反应体系的主要成分及退火温度、循环次数对丝瓜ISSR扩增结果的影响。结果表明:在20μl的反应体系中,Mg2+的用量为2 mmol/L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,引物的浓度为0.6μmol/L,TaqDNA聚合酶的用量为1 U,模板DNA的用量为30 ng,在适当的退火温度下,35个循环能得到清晰、多态性高的ISSR带谱。     

花吊丝竹ISSR反应体系的建立与优化

建立关于花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系,为花吊丝竹种质资源鉴定提供理论基础。采用单因素试验法,对影响PCR扩增效果的Mg~(2+)浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行分析,并利用建立的优化反应体系和扩增程序对100条候选引物进行筛选。结果表明,适合花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系为:20μL的反应液中含3.0 mmol/L Mg~(2+)、0.20 mmol/L d NTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6μmol/L引物、10 ng模板DNA、2μL 10×Buffer、8.55μL dd H_2O。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。建立的花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系能够扩增出清晰、多态性较高的条带,且筛选出的16条引物具有高度多态性。表明该体系具有较高的稳定性、重现性和适用性。     

黑龙江林蛙ISSR反应体系的建立与优化

以黑龙江林蛙为材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板进行体系优化,对引物的最佳退火温度进行选择,建立适合黑龙江林蛙的ISSR-PCR分析的最佳体系:在25μL总体积中,包含10×PCR Buffer 2.5μL,Mg2+4.0 mmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,引物0.3μmol.L-1,TaqDNA聚合酶0.5 U,DNA模板2.0 ng.μL-1,最佳退火温度53.8℃。为利用该技术对黑龙江林蛙遗传多样性分析和构建遗传图谱提供一定的依据。     

牡丹ISSR-PCR反应体系正交优化设计

以“凤丹(”Paeonia ostii)基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,研究牡丹ISSR反应体系的影响因素,建立了适合牡丹的ISSR反应体系及程序。10 lμ反应体系为:1×反应缓冲液,2.5 mmo1/LMg2+,0.4 mmo1/LdNTPs,1.0 UTaq聚合酶,0.75μmol/L引物,10～20 ng模板DNA。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性45 s,45～60(℃不同引物退火温度各异)复性45 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min;4℃保存。通过梯度退火试验,确定不同引物的退火温度。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

烟草赤星病菌 ＩＳＳＲ-ＰＣＲ反应体系的优化

采用改良的CTAB法提取烟草赤星病菌丝基因组DNA，通过正交与单因素变量设计试验，对烟草赤星病菌ISSR—PCR反应体系的各个影响因素进行优化，建立了适合烟草赤星病菌ISSR分子标记的最佳反应体系，即在25μL反应体系中包含10×buffer2．5μL，模板20ng，Mg^2＋浓度2．0mmol／L，引物浓度0．8μmol／L，dNTPs浓度0．2mmol／L，TaqDNA酶0．75U。利用所建立的体系对采自云南昆明、德宏、楚雄、曲靖、玉溪等地8份材料进行检验，其结果表明优化后的体系适合烟草赤星病菌的ISSR-PCR反应。