奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约386 bp的目的序列GnRH/GAP,先将其克隆到T载体上,通过酶切鉴定、序列测定分析,确认序列的正确性后,将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH/GAP,再转化到大肠杆菌TB1中,经IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的相对分子量约56 000的融合蛋白。     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

天麻抗真菌蛋白cDNA克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术扩增出天麻抗真菌蛋白(Gastrodia antifungal protein,GAFP)的cDNA序列,通过pGM-T载体转入大肠杆菌JM109克隆,在培养基上筛选重组质粒酶切鉴定,阳性克隆经限制性内切酶Xba1和Sac1酶切与同样酶切的植物表达载体pBI121连接,构建天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体pBI121-GAFP。结果,天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体构建成功。     

bcl-2/EGFP融合基因真核表达质粒的构建

为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。     

牛粘膜病病毒E1基因的克隆及原核表达

参考BVDVVEDEVAC株的基因组序列及E2基因的测序结果设计一对引物,扩增出预期585 bp的目的片段。扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列VEDE-VAC株比较,二者的核苷酸同源性为100%,推导氨基酸同源性为100%。测序结果经同源性比较,克隆得到的基因与VEDEVAC株同源性最高。系统发生树分析推测E1基因与VEDEVAC株在进化上比较接近。将E1基因定向亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中,对阳性重组质粒转化的大肠杆菌BL21进行诱导,E1基因获得了成功表达。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的原核表达

经PCR从含有OML基因片段的重组质粒App-OML-1中扩增出mAppOML-1基因,同时对目的基因和表达载体pPRoEX HTb进行酶切、连接、转入E.coliBL21,构建重组质粒pPRoAppOML-1.阳性克隆用IPTG进行诱导,经SDS-PAGE电泳鉴定,表达的融合蛋白分子质量约为45 ku,Western-blotting分析表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性.     

固始鸡白细胞介素2基因的克隆、表达及其表达蛋白活性的检测

参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明,表达蛋白主要以包涵体的形式存在,表达蛋白分子质量约为18 ku;目的蛋白表达量占总量的18％。体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性。     

幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位在酵母系统中的表达

【目的】构建幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)P58亚单位酵母双杂交诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与空泡毒素P58亚单位相互作用的蛋白奠定基础。【方法】采用PCR方法,从幽门螺杆菌s1/m1型标准毒株NCT11637基因组中扩增空泡毒素P58亚单位,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后克隆入经同样酶切处理的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,构建pGBKT7-VacA P58重组质粒,并将其转化E.coliDH5α,提取质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切、测序鉴定正确后,转化入宿主酵母菌AH109,色氨酸(Trp)缺陷压力筛选,对阳性转化酵母菌扩大培养,提取总蛋白进行Western-blot鉴定,同时检测重组蛋白有无毒性、渗漏和自激活活性。【结果】成功扩增长度为1202bp的空泡毒素P58片段,重组质粒pGBKT7-VacA P58经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切可得到1202bp大小的片段,测序结果显示扩增产物序列与参考序列完全匹配。重组质粒pGBKT7-VacA P58成功地转化至酵母细胞AH109中。表达的诱饵蛋白无毒性、无渗漏及无自激活活性,Western-blot分析证实酵母菌AH109细胞正确表达了重组蛋白。【结论】成功构建了幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位酵母诱饵表达载体,其可在酵母菌系统中成功表达,且表达产物正确。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

棉花单脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆及原核表达

以棉花纤维组织为材料,根据NCBI棉花EST数据库中MDAR基因序列的已知信息,利用5′-RACE获得GhMDAR基因全长。结果显示,该基因开放读码框为1 305bp,编码包含435个氨基酸的蛋白质,分子质量约为52ku。构建原核表达载体pET28a-GhMDAR并转化大肠杆菌,经过测序和酶切鉴定后,成功构建重组体pET28a-GhMDAR;将重组体导入大肠杆菌BL21诱导表达,经过SDS-PAGE分析,显示成功获得分子质量为52ku左右的诱导表达蛋白GhMDAR。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2部分基因的克隆及原核表达

根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 ORF2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

唾液富组蛋白5的原核表达、纯化与抗菌活性鉴定

设计一对3’端互补、5’端带酶切位点的引物,用PCR扩增唾液富组蛋白5(H5)基因(h5),将我体pGEX4T-2和h5双酶切、连接、转化DH5α,将筛选鉴定的重组质粒pGEX4T-2-h5转化BL21 (DE3).诱导重组菌BL21 (DE3) -pGEX4T-2-h5表达,纯化融合蛋白GST-H5,用Thrombin切去GST标签获取重组H5(rH5),测试rH5抗白色念珠菌(Candida albicans)活性.试验成功构建了重组载体pGEX4T-2-h5,在37℃重组菌BL21 (DE3)-pGEX4T-2-h5生长至OD600nm=0.6时用1 mmol/L IPTG于20℃诱导9h,可获得高水平表达的融合蛋白GST-H5;酶切后获得的rH5对白色念珠菌生长有较强的抑制作用,rH 5产率约2 mg/L.     

牛乳中乳酸乳球菌nisRK基因的克隆与序列分析

以一株分离自牛乳中乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增出乳链菌肽生物合成的双组分调控元件(nisRK基因)。试剂盒回收纯化nisRK基因后将其克隆入以氨苄青霉素为选择压力的pGEM-T克隆载体中,再转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取重组体,进行酶切鉴定和PCR鉴定,并对nisRK基因进行序列测定,与已知序列进行同源性比较。结果表明成功地克隆出nisRK基因,全长为2 035 bp,与国外报道的nisRK基因同源性高达99.9%。     

大鼠热休克因子结合蛋白1原核表达载体的构建及表达

以重组克隆载体pGEM—T—hsbp1为模板,PCR扩增hsbp1,用限制性内切酶双酶切、T4连接酶连接、转化BL -21的方法构建pGEX-2TK-hsbp1原核表达载体,实现了hsbp1在BL21中的表达,SDS—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。