EGF·Insulin和IGF-I对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响

探讨了培养基中不同浓度血清情况下,分别添加不同浓度的表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响,目的是寻找这3种物质促进体外培养成纤维细胞的最佳浓度,改善细胞体外培养系统,为以后体细胞及干细胞培养提供参考。将处于对数生长期的10～15代细胞进行常规消化混匀,计数,接种,培养24h后分别向孔中加入含5％和10％的两种血清浓度、添加不同浓度的EGF、Insulin和IGF-I的培养基,6d后分别向孔中加入MTT,然后用酶联免疫检测仪测定各孔在492nnl处的吸光度值（0D）。血清浓度为10％情况下,培养基中添加10ng／ml EGF、10μg／ml Isulin、100ng／ml IGF-I时,食蟹猴耳部成纤维细胞增殖能力最好。     

EGF·Insulin和IGF-I对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响

探讨了培养基中不同浓度血清情况下,分别添加不同浓度的表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响,目的是寻找这3种物质促进体外培养成纤维细胞的最佳浓度,改善细胞体外培养系统,为以后体细胞及干细胞培养提供参考。将处于对数生长期的10～15代细胞进行常规消化混匀,计数,接种,培养24h后分别向孔中加入含5％和10％的两种血清浓度、添加不同浓度的EGF、Insulin和IGF-I的培养基,6d后分别向孔中加入MTT,然后用酶联免疫检测仪测定各孔在492nnl处的吸光度值（0D）。血清浓度为10％情况下,培养基中添加10ng／ml EGF、10μg／ml Isulin、100ng／ml IGF-I时,食蟹猴耳部成纤维细胞增殖能力最好。     

Roscovitine同期化供核细胞对猴—猪异种核移植胚胎发育的影响

[目的]探讨Roscovitine同期化供核细胞对食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为提高灵长类的核移植效率奠定基础.[方法]活体采集4岁雄性食蟹猴的耳组织,经组织块培养获得纯化的食蟹猴耳成纤维细胞,细胞经固定、染色后用流式细胞仪分析细胞周期分布.以不同同期化方法处理的食蟹猴耳纤维细胞为供体细胞,以体外成熟、去核的猪卵母细胞为受体细胞,利用电融合法构建食蟹猴—猪异种核移植胚胎,观察异种核移植重构胚胎的体外发育情况.[结果]以15 μmol/L Roscovitine处理食蟹猴耳成纤维细胞24、48、72 h获得的G0/G1期细胞比率分别为76.51％、89.69％和90.49％,其中处理48和72h的G0/G1期细胞比率显著高于对照组（P＜0.05）.血清饥饿、接触抑制72 h同期化获得的G0/G1期细胞比率分别为91.12％和90.46％.Roscovitine同期化处理食蟹猴耳成纤维细胞48 h可有效提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率（15.05％）,显著高于血清饥饿同期化处理和接触抑制同期化处理的效果（P＜0.05）.[结论]Roscovitine可有效同期化食蟹猴耳成纤维细胞在G0/G1期,最终提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率.     

南阳牛成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

建立了南阳牛成纤维细胞系,旨在为制备转基因克隆牛提供核供体细胞。以南阳牛耳缘组织作为试验材料,通过组织块法培养分离南阳牛成纤维细胞,并进行生物学特性分析。结果表明,含有15%FBS的DMEM/F12培养基较适合原代牛成纤维细胞的体外培养。分析了细胞冻存前和复苏后的活率,分别为95.9%和90.2%,差异不显著;生长曲线表明细胞生长正常。南阳牛成纤维细胞传至第6代时,细胞核型正常。流式细胞仪检测结果显示,G0-G1期的F4和F8代细胞占细胞总数的64.35%和64.53%,F11代细胞占细胞总数的81.90%。在S期,F4代细胞占细胞总数的30.69%,F11代细胞占细胞总数的16.37%。结果表明,所培养的南阳牛成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛方面的研究。     

藏猪耳部成纤维细胞的分离与培养

用组织块法分离培养藏猪耳部成纤维细胞,并进行体外传代和冷冻,冷冻复苏后的藏猪耳部成纤维细胞仍可以正常培养和传代,冻存前后活率都在90%以上;其生长曲线呈典型的“S”型,细胞接种后,在经历0-2 d的潜伏期后,第3 d细胞开始迅速生长,进入对数生长期,到第10 d细胞开始发生接触抑制,生长缓慢进入平台期。研究结果表明,已成功分离培养到藏猪的耳部成纤维细胞,这将为藏猪的体细胞克隆和保种等方面的研究奠定基础。     

甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞生长和增殖的影响

【研究目的】研究了不同剂量甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核和增殖的影响,在细胞水平上揭示甜菜碱对三黄鸡生长影响的机理,为甜菜碱在动物生产中的应用提供依据。【方法】体外分离培养三黄鸡胚胎成纤维细胞,在培养液中添加不同剂量甜菜碱,观察细胞生长及分裂。【结果】①在基础培养液(DMEM 15%NBS)中添加10mM,20mM甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核率无显著影响;添加30mM,40mM,50mM甜菜碱显著提高三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的微核率。②在基础培养液(DMEM 15%NBS)中添加10mM、20mM甜菜碱能促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,以在培养液中添加20mM甜菜碱时三黄鸡原代成纤维细胞增殖速度最快。添加50mM甜菜碱时抑制了三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖。【结论】低剂量甜菜碱可促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,高剂量甜菜碱对细胞分裂构成危害。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养

为探讨体外分离及培养扩增兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,无菌采取兔股骨,用含20%FBS的DMEM培养液冲骨髓腔,采用全骨髓细胞贴壁培养法对MSCs进行纯化扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况、绘制细胞生长曲线。结果显示,MSCs为贴壁生长细胞,形态均匀呈纤维样,增殖能力强,多次传代仍能保持其生物学特性。采用全骨髓贴壁培养法能够较好地纯化和扩增MSCs。     

食蟹猴——猪异种体细胞核移植胚胎的构建

[目的]探索食蟹猴—猪异种核移植胚胎的发育能力,为食蟹猴异种核移植胚胎干细胞的构建奠定基础.[方法]以食蟹猴和猪胎儿的耳部成纤维细胞为供体,猪MⅡ期去核卵母细胞为受体,构建异种核移植重构胚,并从核移植融合/激活方式、培养液两个方面进行优化.[结果]70枚食蟹猴—猪异种核移植胚胎中,有49枚分裂(70.0%),与猪同种核移植胚胎的分裂率(76.6%)无显著差异;使用微卫星引物D15S823对食蟹猴—猪异种核移植胚胎进行遗传学鉴定,均能扩增获得D15S823条带(350 bp);食蟹猴—猪异种核移植胚胎融合后1h的染色体早熟凝集率(24.2%)显著低于猪同种核移植胚胎(44.7%)和猪孤雌激活胚胎(100.0%),通过使用无Ca2+融合液能够显著提高染色体早熟凝集率(48.2%);在PZM-3、HECM-10和HECM-10+10% FBS 3种培养液中,食蟹猴—猪异种核移植胚胎的分裂率无显著差异.[结论]食蟹猴体细胞核能够在猪MⅡ期去核卵母细胞胞质中发生核重塑,并发育到8-细胞阶段.     

血清浓度对鸡胚盲肠上皮细胞原代培养的影响

为探讨细胞培养基中血清浓度对鸡盲肠上皮细胞体外培养的影响,分别用含0%、2.5%、5%和10%胎牛血清(FBS)的细胞培养液培养鸡胚盲肠上皮细胞,检测细胞活性;选择适宜的FBS浓度,并测定了该浓度条件下鸡盲肠上皮细胞的生长特性。结果表明:用含2.5%和5%FBS的培养基培养鸡胚盲肠上皮细胞,第4天细胞贴壁率达最高,分别为84%和80.33%,显著地高于无血清和10%FBS组(P<0.01/0.05),第7天仍均维持在76%以上,两者间除了第2天外,其余差异均不显著;用含2.5%FBS的细胞培养基进行鸡胚盲肠上皮细胞原代培养,第2~3天为适应阶段,第3~5天处于对数生长期,第5~9天细胞进入减速期,第10~11天再次进入对数生长期,第11天以后细胞进入衰退期,整个过程持续14 d左右。鸡胚盲肠上皮细胞培养的血清浓度以2.5%FBS为宜。     

奶山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

试验分别采用组织块贴壁法和消化分离法对奶山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功建立了奶山羊胎儿成纤维细胞系,并对该细胞系进行了形态学观察、生长动力学分析、细胞活力测定、核型分析和微生物检测等多种生物学特性分析.结果表明:成纤维细胞原代培养采用贴块培养时所需时间较长,消化培养有较多死细胞;传代细胞生长情况良好,群体倍增时间(PDT)约为40.4h;生长总体趋势呈"S"型;冻存后活力为92.3%,生长状况与冻存前一致;细胞染色体中二倍体(2 n=60)占主体;细菌、真菌和支原体检测结果均为阴性,细胞系的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准.     

不同培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果研究

[目的]比较3种培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果。[方法]采用DMEM+10%血清、低血清培养基(MEM-MD-611)、无血清培养基(SFE4Mega)3种培养基制备MDCK细胞单层,分别接种不同稀释度的H9亚型禽流感病毒。然后,分别加入含10μg/ml胰蛋白酶的3种培养基作为维持液,培养病毒,每隔24 h观察其细胞病变,并测定上清HA滴度。[结果]在培养72～96 h时,无血清培养基病毒液的HA滴度高于低血清培养基,而低血清培养基则高于含血清培养基。[结论]3种培养基均可用于制备禽流感病毒抗原,其中无血清培养基、低血清培养基更适用于流感病毒抗原的制备。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

广西巴马小型猪成纤维细胞体外培养体系的建立

为建立广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞体外培养体系,以新生巴马小型猪为试验材料,使用微量液体组织块贴壁法原代培养分离几种成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;根据细胞的形态、生长特性等观察其体外生长能力和增殖寿命.结果显示,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞获得成功分离,体外可以传代和冷冻;冷冻复苏后仍可以正常培养和传代;腹部成纤维细胞免疫荧光检测结果显示波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性.研究成果可为显微操作核移植、手工核移植和转基因相关操作等提供不同类型的供体材料.     

食蟹猴支持细胞的分离、纯化以及不同血清浓度对其增殖的影响研究

[目的]纯化培养食蟹猴支持细胞,并测定不同血清浓度对细胞增殖的影响。[方法]分离并纯化食蟹猴支持细胞后,分别以5%、10%、15%、20%4种不同血清浓度的培养基对食蟹猴支持细胞进行培养。利用MTT比色法判断支持细胞的增殖情况,从而确定最佳的血清培养浓度。[结果]5%血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与10%血清浓度的培养基差异不显著,15%与20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异不显著,5%、10%与15%、20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异极显著。[结论]15%的血清浓度是支持细胞增殖的最佳比例。     

不同培养条件下欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞的生长优势

为建立欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,以欧洲鳗鲡胸鳍细胞人工培养适应株(第21代)为试验材料,采用人工培养基体外传代培养的方法,探讨欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件。观察比较不同培养基(L-15、RPMI-1640、高糖型DMEM)、血清成分(BS和FBS)及其浓度(5%、10%、15%、20%)对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长状态的影响。结果表明:含有10%胎牛血清(FBS)的L-15培养基最适合欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

不同冻存保护剂对绵羊前体脂肪细胞冻存效果的影响

【目的】探讨绵羊前体脂肪细胞冷冻保存的最佳冻存保护剂种类和浓度。【方法】在含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中分别添加不同浓度的DMSO、EG、PG、G和PVP作为冻存液,对原代培养的绵羊前体脂肪细胞进行冷冻保存后,检测复苏细胞存活率、细胞增殖能力、细胞中脂肪沉积量,测量GPDH活性,并用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平,最后对复苏细胞进行染色体核型分析。【结果】各种冻存保护液中,10% DMSO和5% DMSO+5% PVP组细胞存活率最高,与对照组相比差异不显著（P＞0.05）,其它各试验组复苏细胞存活率均显著低于对照组（P＜0.05）;各试验组中10% DMSO组细胞增殖能力最强,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;细胞复苏后培养6 d,各试验组脂肪沉积量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）,而第11天时,10 % DMSO组脂肪沉积量显著高于其它试验组（P＜0.05）,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;各试验组GPDH活性和LPL、PPARγ mRNA 的表达量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）;染色体核型分析发现,复苏细胞二倍体细胞占主体,与原代细胞没有显著差异（P＞0.05）。【结论】含20% FBS的DMEM/F12培养液中添加10% DMSO或10%PVP、5% DMSO+5% PVP均能有效保存绵羊前体脂肪细胞,但以10% DMSO最佳。     

山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化

【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基（20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素）培养于37℃、5% CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、MyoD1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基（2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素）,诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成cDNA后,利用qPCR测定MyoD1和Myog的相对表达量。【结果】 分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和MyoD1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,qPCR结果显示,标志基因MyoD1和Myog均有表达,且MyoD1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.