应用RT-PCR法快速检测马铃薯X病毒

根据马铃薯X病毒的外壳蛋白基因序列 ,设计合成了 1对寡核苷酸引物 ,从感染PVX的马铃薯病叶组织中提取出病毒的RNA ,进行cDNA合成和PCR扩增 ,得到一条长度约为0 .72kb的特异性PCR扩增产物 ,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。在基因水平上为PVX的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法 ,为PVX的防治提供了有效手段。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

病毒外壳蛋白基因在马铃薯基因组中的整合与转录表达

以表达马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的转基因马铃薯植株为供试材料,在接种病毒后续发感染条件下提取转基因植株ＤＮＡ和ＲＮＡ,用克隆的病毒ＣＰ基因ｃＤＮＡ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,结果表明,外源ＣＰ基因稳定整合于马铃薯基因组内,并在转录水平上高效表达．     

四川省马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立

根据5种主要的马铃薯病毒外壳蛋白基因序列,分别合成了5对寡聚核苷酸引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物。建立了马铃薯病毒检测的RT-PCR体系,并将建立的体系应用于四川省的马铃薯病毒病的检测,在基因水平上为四川省的马铃薯检测提供了新的手段。     

冬种马铃薯卷叶病田间调查及RT-PCR检测技术研究

对惠州市冬种马铃薯卷叶病发病情况进行调查研究,建立了马铃薯卷叶病毒(PLRV)RT-PCR检测技术。结果表明,马铃薯卷叶病发病率为3.0%～29.7%。比较LiCl、异硫氰酸胍和试剂盒3种方法提取马铃薯卷叶病毒总RNA,以异硫氰酸胍和试剂盒提取效果较好,LiCl次之;根据卷叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,从感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,合成cDNA并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约336bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康叶片RNA扩增未得到任何产物。应用RT-PCR技术对马铃薯试管苗和种薯进行了卷叶病毒检测。     

马铃薯卷叶病毒福建分离物的基因克隆与序列分析

依据马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链式反应扩增得到了PLRV福建分离物外壳蛋白基因,克隆并测定了其核苷酸序列,进行了同源性分析.依据PLRV外壳蛋白氨基酸序列建立了PLRV不同分离物的系统进化树.     

青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测

根据马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白基因的保守序列设计了一对寡聚核苷酸引物,从田间自然感染PLRV的马铃薯病株中提取病毒总RNA,用反转录-聚合酶链式反应扩增出符合设计大小240bp的特异性产物,而对照没有任何扩增产物。建立了快速、准确检验PLRV的分子检测方法,为青海省马铃薯生产中卷叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

IBDV南京野毒株VP2结构蛋白基因克隆与表达

用微机辅助设计合成了一对引物，用于扩增传染性法氏囊病病毒中国地方株ＶＰ２基因片段。ＲＴ－ＰＣＲ增出－１３２１ｂｐ的目的的片段，分子杂交鉴定为ＶＰ２基因。     

猪瘟病毒石门株NS5A基因的序列测定及同源比较

根据已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了３对引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从猪瘟病毒石门株感染猪血中成功扩增了各ｃＤＮＡ片段,覆盖整个ＮＳ５Ａ基因,片段大小各为７７４,６８５,９１７ｂｐ。克隆后测序。序列比较结果显示,该基因在ＣＳＦＶ中较为保守。与同属的ＢＶＤＶ的序列同源性较低,且氨基酸的同源性低于核苷酸的同源性。推测它参与决定瘟病毒的特异性。     

河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。     

马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立

依据马铃薯病毒PVS、PVX、PLRV、PVA的CP保守序列设计特异性引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物,建立了能够同步检测PVS、PVX、PLRV、PVA的RT-PCR多重检测体系。该方法对PVS、PVX、PLRV、PVA扩增出的靶带大小分别为435、625、222、300 bp,凝胶电泳易辨别区分。研究结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、快速简便,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

双重RT-PCR法快速检测多种马铃薯病毒的研究

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。