我国根瘤菌共生固氮遗传学研究动态

本文就我国根瘤菌固氮的遗传学研究动态做一综述，内容包括根瘤菌共生固氮的遗传基础研究，如根瘤菌结瘤基因和固氮基因的定位，外源质粒与根瘤菌共生质粒的相互作用与遗传重组等，根瘤菌与豆科植物的相访识别与作用；以及我国根瘤菌遗传学研究展望。     

大豆快生根瘤菌SfHH103_03182基因突变体的构建和共生固氮表型分析

以大豆快生根瘤菌HH103中glnK同源基因SfHH103_03182为研究对象,采用pK19mob单插入失活技术构建该基因的插入失活突变体,菌落PCR和测序分析表明突变体构建正确。植物盆栽试验结果显示,与接种野生型菌株HH103相比,突变体接种植株的根瘤数量增多,植株鲜质量和根瘤鲜质量增加,根瘤固氮酶活无显著差异。在不同浓度氮素处理和盆栽条件下,对共生表型的检测表明突变体接种植物的根瘤数量没有显著变化。     

Co对花生—根瘤菌共生固氮的促生作用

在控制性水培条件下，Ｃｏ的不同处理对花生根瘤菌的生长繁殖，结瘤固氮及对花生的生长发育有促进效应。Ｃｏ能刺激花生根瘤菌菌落的生长，提高花生单株结瘤数及瘤鲜重，花生生物学产量及叶绿素含量，降低根／冠比。     

导入dctABD和nifa基因对苜蓿中华根瘤菌共生固氮效率的影响

将克隆有四碳二羧酸转移酶基因dctABD、nifA基因和发光酶基因luxAB的重组质粒pHN307经三亲本杂交分别导入苜蓿根瘤菌HNM1、HNM2、HNM4和1021中得到HNM1（pHN307）等4个转移接合子，进一步比较研究了pHN307在自生培养条件下传代的稳定性，并采用本室改进的双层钵无菌砂培盆栽法，分别将4个转移接合子和出发菌接种到苜蓿品种草原1号，公农1号和图牧2号结果表明．只有用转移接合子HNM4（pHN307）和1021（pHN307）接种到草原1号和图牧2号的植株鲜重和干重明显优于出发菌     

4种除草剂对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮的影响

在室内条件下,研究了乙羧氟草醚、三氟羧草醚、乙草胺和异丙甲草胺等4种除草剂对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮的影响。结果表明:4种除草剂均能对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮产生一定的抑制作用,其中以乙羧氟草醚的抑制作用最强,在高剂量下鲜重抑制率和干重抑制率分别为68.5%,70.6%,与对照植株的结瘤率和总含氮量92%和2.620%相比,其结瘤率和总含氮量为31%和0.072%;异丙甲草胺的抑制作用最弱,高剂量下鲜重抑制率和干重抑制率分别为18.5%和26.8%,与对照植株的结瘤率和总含氮量94%和2.136%相比,其结瘤率和总含氮量为60%及0.482%;紫花苜蓿经四种除草剂不同剂量处理后,总含氮量远远低于对照植株的总含氮量。     

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK_8182基因的共生固氮功能

根据华癸中慢生根瘤菌7653R全局转录组分析结果,获得在共生固氮阶段显著上调表达的基因MCHK_8182;设计重叠延伸PCR引物,构建MCHK_8182双交换突变重组质粒载体;通过三亲本杂交,将突变载体导入7653R;在蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK_8182双交换突变株。PCR及测序验证双交换突变株构建成功。植物盆栽试验结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK_8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异。     

4种除草剂对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮的影响

在室内条件下,研究了乙羧氟草醚、三氟羧草醚、乙草胺和异丙甲草胺等4种除草剂对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮的影响。结果表明:4种除草剂均能对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮产生一定的抑制作用,其中以乙羧氟草醚的抑制作用最强,在高剂量下鲜重抑制率和干重抑制率分别为68.5%,70.6%,与对照植株的结瘤率和总含氮量92%和2.620%相比,其结瘤率和总含氮量为31%和0.072%;异丙甲草胺的抑制作用最弱,高剂量下鲜重抑制率和干重抑制率分别为18.5%和26.8%,与对照植株的结瘤率和总含氮量94%和2.136%相比,其结瘤率和总含氮量为60%及0.482%;紫花苜蓿经四种除草剂不同剂量处理后,总含氮量远远低于对照植株的总含氮量。     

费氏中华根瘤菌共生质粒缺失对结瘤和固氮能力的影响

费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii)HN01在大豆上的结瘤表现为非品种专一性，其共生质粒pSymHN01b在诱动转入另一非品种专一性结瘤菌株WWG18SR后，获得的转移接合子WWG18SRN1中的pSymHN01b缺失约40b。盆栽结瘤试验证明，pSymHN01b的缺失导致WWG18SRN1由非品种结瘤菌株转变为大豆品种专一性结瘤菌株，并失去了在所有供试的大豆品种上固氮的能力。在获得了完整的pSymHN01b的转移接合子WWG18SRN2存在时，WWG18SRN1在黑农33上的结瘤受到抑制。     

丛枝菌根真菌和根瘤菌对蚕豆吸收磷和氮的促进作用

以有机磷为磷源 ,采用盆栽试验研究了接种根瘤菌、AM真菌和双接种对蚕豆 (ViciafabaL .)吸收磷和氮的影响。双接种和单接AM真菌蚕豆株高、叶绿素含量、根瘤数和根瘤质量显著增加 ,生物量比对照增加 2 1 5 %和 2 0 7% ;双接种比单接AM真菌蚕豆菌根侵染率提高 12 0 % ;相对于对照 ,双接种使根际土壤酸性和碱性磷酸酶活性分别由 0 6 9和 0 39增加到 1 30和 0 5 4 μmol·g-1·h-1,磷和氮吸收速率提高 5 0 9%和 2 2 0 % ,吸收有机磷和氮分别增加 6 3 9%和 4 4 8% ,高于单接AM真菌。菌根真菌和固氮微生物双接种对改善作物生长有重要意义。     

MCHK＿7135基因在华癸中慢生根瘤菌共生固氮中的功能

为研究MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮中的功能,用同源重组的方法构建了MCHK＿7135基因的突变体及回补菌株,对突变菌株和回补菌株在人工培养条件以及与宿主植物紫云英共生下的各项表型进行了考察,结果显示：与野生型菌株相比,突变菌株对氧胁迫的敏感性增强;接种突变株的紫云英长势矮小,侵染线及根瘤原基数目减少,根瘤数量少,固氮酶活性低,而向突变菌株导入完整MCHK＿7135基因后,各项共生表型得到不同程度恢复。研究结果表明,华癸中慢生根瘤菌的过氧化物还原酶基因MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮的过程中具有重要功能。     

紫云英非特异性转脂蛋白AsIB259的体外酶活性及在共生固氮中的功能

将紫云英AsIB259基因编码的一个预测的非特异性转脂蛋白AsIB259(nsLTP,non-specific lipid transfer protein)在大肠杆菌表达菌株Rosetta 2(DE3)中进行了诱导表达,体外测定AsIB259蛋白的脂质结合动力学特征,检测它对不同碳链长度脂肪酸及其衍生物的结合能力,进一步考查AsIB259超表达对紫云英毛根结瘤情况的影响。结果表明:AsIB259具有转脂蛋白的典型特征,与16~22碳链长度脂肪酸的结合活性较强,对茉莉酸也表现出一定的结合活性;AsIB259超表达导致根瘤数量增加1.5倍且固氮酶活性降低,说明该基因在根瘤形成和固氮过程中发挥重要作用。     

天冬氨酸转氨酶在中慢生根瘤菌MAFF303099共生固氮中的作用

为寻找根瘤菌中与共生固氮相关的调控基因,采用同源重组法,分别敲除中慢生根瘤菌MAFF303099在与豆科植物百脉根共生固氮过程上调表达的10个基因,研究它们对共生固氮的影响。结果显示:Δmlr5883敲除突变体相比于野生型MAFF303099,其固氮酶活性下降40%,侵染细胞形态未发生显著改变,对Δmlr5883回补可恢复固氮酶活性;预测mlr5883编码天冬氨酸氨基转移酶,体外检测该酶的天冬氨酸转氨酶活性为16.67 U/mg。该基因的突变会影响固氮效率,推测其可能参与对植物供给碳源的代谢过程。     

类枯草杆菌蛋白酶基因GmSBT1在大豆共生固氮中的功能

为研究SBT（subtilases）家族蛋白在豆科植物共生固氮中的作用机制,分别利用生物信息学分析、时空表达定位、GUS 染色定位和基因沉默等方法来研究GmSBT1在大豆-根瘤菌共生中的作用。结果显示：GmSBT1受根瘤菌特异性诱导,在成熟根瘤中高量表达,且在根瘤皮层以及含菌细胞中发挥功能。GmSBT1-RNAi植株地上鲜质量、瘤质量、固氮酶活显著降低。结果表明 ,GmSBT1 蛋白对根瘤的形成和发育以及根瘤的固氮具有重要的作用。     

微生物与植物共生结瘤固氮的分子遗传学研究进展

以根瘤菌 -豆科植物共生体系为主要代表 ,综述了近年来在结瘤固氮分子遗传学研究领域所取得的进展 ,特别是共生双方与结瘤、固氮有关的基因的定位、表达与调控     

华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。     

半无叶型豌豆根瘤菌接种效应及其竞争结瘤能力分析

【目的】研究不同根瘤菌株对豌豆生长发育、产量及品质的影响,并分析比较不同根瘤菌株的竞争结瘤能力,筛选出与供试豌豆品种匹配较好的根瘤菌株。【方法】在盆栽条件下,应用湖南省华容县棉田低氮土壤,对加拿大半无叶型豌豆MISER分别接种9株豌豆根瘤菌（CCBAU 33109、CCBAU 43228、CCBAU 43227、CCBAU 43232、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43242及商用菌株F98-1和F98-4）。测定豌豆的生育时期;在豌豆盛花期测定豌豆的主要生育特征、根瘤菌的结瘤固氮性能,并用BOX-PCR指纹图谱技术测定根瘤菌的占瘤率;在成熟期测定豌豆的主要生育特征、产量、产量构成因子,及其干籽粒粗蛋白、粗纤维含量。【结果】与不接种对照（CK）相比,接种CCBAU 33109后,MISER盛荚期和成熟期分别延长4.1和7 d（P＜0.05,下同）;接种ACCC 16058后,主茎节数在成熟期分别比对照、F98-1和F98-4多2.8、3.8和2.9节,株高比F98-4高15.67%,粗蛋白含量比对照和F98-1分别提高9.88%和10.63%;接种CCBAU 41242后,豌豆单株籽粒鲜重比商用菌株F98-1提高40.46%;接种菌株CCBAU 43228的占瘤率最高,为57.50%。【结论】根据接种根瘤菌对豌豆生长发育、产量以及品质等方面的影响,结合各根瘤菌株的竞争结瘤能力,本研究筛选出较适于豌豆MISER的豌豆根瘤菌株CCBAU 33109、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43228。     

豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

通过两亲本接合转移,将豌豆根瘤菌T83K3共生质粒pJB5JI转入费氏中华根瘤菌HN01及其质粒缺失突变株中,获得8个转移接合子,其中受体为HN01和pSfrHN01a缺失突变株HND28的接合子能够在大豆上形成有效根瘤,无论是人工传代还是与植物共生,外源质粒pJB5JI与受体菌内源质粒均能稳定存在,但不能在豌豆上结瘤,与大豆共生固氮能力和竞争结瘤能力与受体菌亲本相比没有明显变化.消除共生质粒的突变株HND29和共生质粒与pSfrHN01a质粒均消除的突变株HND100作受体菌的接合子,既不能在大豆上结瘤,也不能在豌豆上结瘤.研究结果表明,pJB5JI与HN01的3个质粒属于不同的不相容群.pJB5JI在HN01中的表达功能可能受到受体菌的共生质粒和染色体基因的共同影响.