胸膜肺炎放线杆菌毒力因子重组蛋白免疫原性研究

【目的】研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)重组亚单位疫苗的免疫保护效果。【方法】用1.0mmol/LIPTG诱导重组表达质粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1,SDS-PAGE鉴定。纯化的表达产物通过Western blot分析有较好的免疫原性。将rApxⅠ、rApxⅢ和rOmp组合作为疫苗Ⅰ组,rApxⅠ、rApxⅢ、rOmp和灭活菌苗组合作为疫苗Ⅱ组,APP 1、3、7型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBSⅣ作为空白对照组,进行家兔的免疫试验。免疫共分2次,每次间隔2周。【结果】疫苗Ⅱ组的抗体水平均显著高于疫苗Ⅲ组,疫苗Ⅰ组抗体水平不如疫苗Ⅲ组,其血清效价最高滴度为1∶256。【结论】猪传染性胸膜肺炎毒力因子重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究新型亚单位疫苗奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究

将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMcaCl<,2>的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化Apx Ⅰ.将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变化观察.将纯化的Apx Ⅰ与弗氏佐剂按1:1的比例混合制备亚单位疫苗,免疫小鼠,初免2周后加强免疫1次,二免2周后用血清10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,测定最佳免疫剂量.根据最佳免疫剂量于30日龄和45日龄免疫小鼠,60日龄时分别用血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒.结果该毒素对小鼠的LD50为80.9mg/kg,LD50的95%平均可信限为63.2～103.5mg/kg;Apx Ⅰ亚单位疫苗的最佳免疫剂量为40μg,对血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌的攻击具有一定的免疫保护效果.     

猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

 从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌（APP）的分离鉴定，采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP，其中，血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株，血清7型、5型为优势血清型。不同地区分离的APP血清型不同，同一地区也存在不同的血清型。PCR检测结果表明，不同血清型的 APP共含有4种溶血毒素(Apx)，其中，血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，血清5型含ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ，血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ，20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素，表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性。毒素序列分析结果表明，相同毒素型APP，其毒素基因序列的同源性在99.5％~100％之间，与血清型无关。致病性试验结果表明，所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同，其中含ApxⅠ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强。该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础。     

仔猪传染性胸膜肺炎母源抗体消长规律的研究

为制定合理的猪传染性胸膜肺炎免疫程序和确定仔猪的首免日龄,试验检测产前接种猪传染性胸膜肺炎多价疫苗(Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ型)母猪所产仔猪传染性胸膜肺炎母源抗体消长的规律。结果显示,仔猪Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ型传染性胸膜肺炎母源抗体整体上随日龄的增加而逐步降低,在42~50日龄(Ⅰ型)、28日龄(Ⅶ型)处于抗体保护临界值,抗体阳性率低于合格率;至70日龄(Ⅰ型)、60日龄(Ⅶ型)、35日龄(Ⅱ型)全部转阴。由结果得出,仔猪Ⅰ型传染性胸膜肺炎疫苗的首免时间应在42~50日龄,Ⅶ型在28日龄左右为宜。而仔猪Ⅱ型传染性胸膜肺炎母源抗体的水平和阳性率较低,不能对仔猪产生较好的保护,且多价猪传染性胸膜肺炎疫苗的首免时间不统一,提示还需深入研发猪传染性胸膜肺炎多价疫苗,才能使其达到更好的免疫效果。     

荧光假单胞菌灭活疫苗对草鱼的免疫保护效应

从患病草鱼分离出荧光假单胞菌,制备甲醛灭活全菌苗、高温灭活全菌苗、可溶性蛋白及外膜蛋白疫苗.经腹腔注射草鱼后,研究这些疫苗的免疫保护作用.免疫后于不同时间采集血液,用试管凝集法测定血清抗体滴度.实验结果表明,上述疫苗均诱导较强的免疫应答.抗体峰值出现的先后顺序依次为可溶性蛋白组、外膜蛋白组、甲醛灭活全菌苗组及高温灭活全菌苗组;而抗体峰值从高到低依次为甲醛灭活全菌苗组、高温灭活全菌苗组、可溶性蛋白组及外膜蛋白组.细菌攻毒实验显示,4种疫苗免疫后均产生明显的保护效应.其中,高温灭活全菌苗相对保护率最高,达到75%,甲醛灭活全菌苗、外膜蛋白以及可溶性蛋白的相对保护率分别为70%,70%和65%,说明这些疫苗均可用于预防草鱼赤皮病.此外,实验亦显示血清抗体水平与疫苗保护效应并不完全一致.     

荧光假单胞菌灭活疫苗对草鱼的免疫保护效应

从患病草鱼分离出荧光假单胞菌,制备甲醛灭活全菌苗、高温灭活全菌苗、可溶性蛋白及外膜蛋白疫苗。经腹腔注射草鱼后,研究这些疫苗的免疫保护作用。免疫后于不同时间采集血液,用试管凝集法测定血清抗体滴度。实验结果表明,上述疫苗均诱导较强的免疫应答。抗体峰值出现的先后顺序依次为可溶性蛋白组、外膜蛋白组、甲醛灭活全菌苗组及高温灭活全菌苗组;而抗体峰值从高到低依次为甲醛灭活全菌苗组、高温灭活全菌苗组、可溶性蛋白组及外膜蛋白组。细菌攻毒实验显示,4种疫苗免疫后均产生明显的保护效应。其中,高温灭活全菌苗相对保护率最高,达到75%,甲醛灭活全菌苗、外膜蛋白以及可溶性蛋白的相对保护率分别为70%,70%和65%,说明这些疫苗均可用于预防草鱼赤皮病。此外,实验亦显示血清抗体水平与疫苗保护效应并不完全一致。     

猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗在小鼠体内的免疫机制及其保护效力

 【目的】欲构建具有较好交叉免疫保护效果的多组分重组亚单位疫苗，从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。【方法】 利用分子克隆和重组表达技术获得了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP。并设立以灭活苗（5×108cfu）为试验I组，以重组蛋白rApxI、rApxII、rApxIII和rOMP为试验II组，以rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP为试验III组，以PBS为空白对照组。分3次免疫BALB/c小鼠，每次间隔2周，第3次免疫后的第7天以APP1型（5×109cfu）和APP2型（5×1010cfu）进行攻毒保护试验。【结果】试验II组的4种抗体水平（ApxI、ApxII、ApxIII和OMP）和脾淋巴细胞诱生IL-2水平显著高于其它3组(P<0.05)，脾淋巴细胞增殖水平也一直高于其它3组(P>0.05)。且试验II组对APP1型保护作用（9/10）明显高于试验I组（6/10）、试验III组(5/10)和对照组（0/10），而对APP2型保护作用（无肺脏损伤）也明显优于其它3组（典型肺部损伤），显示出细胞免疫和体液免疫水平与免疫攻毒保护之间存在着正相关性。【结论】试验II组通过激活体液免疫和细胞免疫，对不同血清型APP的攻击提供了很好的交叉保护作用。     

间接ELISA检测胸膜肺炎放线杆菌血清1型抗体的研究

进行了胸膜肺炎放线杆菌血清1型荚膜多糖的提取制备实验,并以该抗原作为诊断抗原建立了检测胸膜肺炎放线杆菌血清1型抗体的间接ELISA方法。此抗原与猪巴氏杆菌病、猪布氏杆菌病、仔猪副伤寒等阳性血清无交叉反应;与胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、10型标准阳性血清也无交叉反应。可用于猪群感染血清1型胸膜肺炎放线杆菌的诊断和监测。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅲ基因克隆、序列分析及表达

参照已知猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株毒素Ⅲ(ApxⅢA)序列设计1对特异性引物，经PCR扩增得到目的片段约1096bp，然后克隆人pMD18＼|T载体中，经测序比较，与标准序列的核苷酸同源性达98．5％。从T-载体中切下目的片段后，定向克隆人pET32a( )中，转化BL21(DE3)，经诱导后，SDS—PAGE结果显示，毒素Ⅲ得到高效表达，Western—blotting检测呈阳性。这为研制猪传染性胸膜肺炎新型疫苗和建立有效的诊断方法奠定了基础。     

猪产毒多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的细胞毒性及其抗体的制备

将猪产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenicPasteurella multocida,T+Pm)增菌后经超声波破碎,用DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-200处理,提纯天然多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素(Pasteurella multocidatoxin,PMT)。经Western blot和细胞毒性试验证实,该毒素具有良好的反应原性,且7 ng/mL的PMT能使Vero细胞病变。用该毒素制成的类毒素菌苗免疫2头健康断奶仔猪,同时设T+Pm灭活苗和PBS对照组。4次免疫后,琼脂扩散试验检测类毒素菌苗组毒素抗体效价达1∶16,而灭活苗组未见毒素抗体产生。用200μg提纯的PMT和50亿T+Pm混合液经耳静脉攻毒各组试验猪,结果发现对照组和灭活苗组试验猪在攻毒后出现明显的急性败血症状,未产生毒素抗体;类毒素菌苗组试验猪10 d后耐过,经颈动脉采血收集高免血清,效价达1∶32。     

BBDL菌种制剂预防仔猪大肠杆菌病的效果

为探讨ＢＢＤＬ菌种制剂对仔猪大肠杆菌病的防治效果,给初生仔猪每天每头口服６３亿个ＢＢＤＬ菌为试验Ａ组,不给口服菌或药物的仔猪为空白对照。给断奶仔猪每天每头口服３１．５亿个菌为试验Ｂ组,以每天每头口服０．１ｇ痢特灵的断奶仔猪为对照。试验期７ｄ,观察ＢＢ－ＤＬ菌制剂对仔猪大肠杆菌病的预防效果。结果：初生仔猪服用ＢＢＤＬ菌制剂的仔猪保护率为１００％,空白对照发生大肠杆菌病２０％（Ｐ＜０．０１）。断奶仔猪的试验组保护率为１００％,痢特灵药物对照发病率１０％（Ｐ＜０．０１）,差异均极显著。从而得出结论：用ＢＢＤＬ菌制剂预防仔猪大肠杆菌病有良好的效果,可替代部分抗生药物。     

鸡IBD蜂胶囊毒组织灭活苗的研制与应用

为了预防鸡IBD的区域性流行,以当地典型发病鸡群的法氏囊为组织源,以蜂胶为佐剂,研制鸡IBD蜂胶囊毒组织灭活苗。室内试验表明,对10日龄AA肉鸡接种后,20、50d血清AGP抗体阳性率和对强毒攻击的保护率均达100%;田间试验表明,对6批7~15日龄,3万多只不同品种的雏鸡免疫,未发生一起IBD;常规检验表明,该苗安全、无毒副作用,保存期内性质稳定。     

大黄鱼弧菌病综合防治对策的初步研究

在5月下旬用哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活菌苗对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)幼鱼进行浸泡免疫，7月至8月高温季节投喂添加防病药物或者uharveyi灭活菌苗的配合饲料，进行了综合防病试验。试验结果表明，uharveyi灭活菌苗浸泡免疫接种可以有效地预防uharveyi对受免大黄鱼的感染，但是，受免鱼对副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的感染则没有显著的保护；高温季节投喂添加药物的配合饲料能够有效地降低大黄鱼的死亡率，而将药物添加在鱼糜中后的投喂方式则不能获得明显防病效果；对受免鱼口服灭活菌苗后在56d内仍然可以观察到加强免疫效果。     

Cloning, Expression of apxI Gene of Actinobacillus pleuropneumoniae and Development of ELISA

Based on the published nucleotide sequence of the apxICA of Actinobacillus pleuropneumoniaein Genbank(S4074), a pair of primers were designed. A 3 640 bp(4 687 -8 326 bp)gene fragment was ampli-fied by PCR from the isolated strain of A. pleuropneumoniae serovar 1. Then, it was cloned into pMD18-T,identified by both restriction endonuclease and sequence analysis, and inserted into pET-28a expression vectorto yield the expression plasmid. SDS-PAGE result indicated expression of apxICA in BL21 (DE3), Westernblot analysis showed the protein's immunogenicity. Using the expressed protein, ELISA was established to de-tect serum antibody against ApxI. The feature of ELISA to detect highly virulent A. pleuropneumoniae strainsinfection was proved by primary clinical application.     

Efficacy of murine malaria sporozoite vaccines: implications for human vaccine development

As part of a study of potential vaccines against malaria, the protective efficacy of sporozoite subunit vaccines was determined by using the Plasmodium berghei murine malaria model. Mice were immunized with recombinant DNA-produced or synthetic peptide-carrier subunit vaccines derived from the repetitive epitopes of the Plasmodium berghei circumsporozoite gene, or with radiation-attenuated sporozoites. Immunization with subunit vaccines elicited humoral responses that were equivalent to or greater than those elicited by irradiated sporozoites, yet the protection against sporozoite challenge induced by either of the subunit vaccines was far less than that achieved by immunization with attenuated sporozoites. Passive and adoptive transfer studies demonstrated that subunit vaccines elicited predominantly antibody-mediated protection that was easily overcome whereas irradiated sporozoites induced potent cell-mediated immunity that protected against high challenge doses of sporozoites. These studies indicate that new strategies designed to induce cellular immunity will be required for efficacious sporozoite vaccines.     

Cloning and Expression of Actinobacillus pleuropneumoniae Gene Coding for TbpA and Development of an Indirect TbpA-ELISA

This study presents the cloning and expression of gene encoding transferrin-binding protein A from Actinobacillus pleuropneurnoniae in Escherichia coli expression system and the development of an indirect TbpA-ELISA. The gene coding TbpA was amplified from the A. pleuropneumoniae serotype 2 genome using polymerase chain reaction and cloned to pET-28b expression vector under the control of strong, inducible T7 promoter. The recombinant plasmid was expressed in E. coli BL21 （DE3）. The expressed fusion protein was analyzed using SDS-PAGE and Western blotting. The diagnostic potential of recombinant TbpA （rTbpA） was evaluated through an antibody-detection indirect ELISA based on the purified rTbpA. The TbpA antibodies were detectable in mice on day 7 after vaccination with purified rTbpA protein or infection with A. pleuropneumoniae serotype 10 with the TbpA-based ELISA. In addition, the TbpA-ELISA was able to detect 12 serotyping rabbit antisera postinoculation （PI） with A. pleuropneumoniae 12 serotypes experimentally. The comparable result was obtained by detecting the 117 clinical serum samples using, respectively, the TbpA-ELISA and indirect hemagglutination test （IHA） based on multiplex antigen. The result indicates that the TbpA-ELISA was the more sensitive method compared with the Mix-IHA method because of its consistent presence in A. pleuropneumoniae serotypes. In conclusion, the conserved TbpA of A. pleuropneumoniae can be used for the development of a cross-serotype diagnostic method for the detection of antibodies against A. pleuropneurnoniae.     

融合蛋白VP4-STI的免疫效果观察

为了研究融合蛋白VP4-STI的免疫效果。将40只小鼠随机分为实验疫苗组(30μg VP4-STI+0.6μg LTB)、铝胶疫苗组[30μg VP4-STI+Al(OH)3胶]、纯化蛋白VP4-STI疫苗组(30μg VP4-STI)和PBS对照组,通过鼻腔滴入进行免疫,测定其抗体水平。用大肠杆菌强毒株C83902进行攻毒试验,观测各免疫组小鼠的保护效果。除PBS对照组外,其余各组均有抗VP4-STI抗体产生,第6周最高,铝胶疫苗组的抗体水平略高于实验疫苗组,纯化蛋白VP4-STI免疫组较低,与实验疫苗组差异极显著(P<0.001)。实验疫苗组和铝胶疫苗组小鼠对大肠杆菌强毒株C83902均有较好的免疫保护效果,与对照PBS组有明显差异。该研究为进一步提高STI的免疫原性提供了依据。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

鸡新城疫疫苗不同剂量饮水免疫效果研究

目前在我国广大的养殖户中存在着不同的新城疫饮水免疫使用剂量,为了探索一个最佳的剂量以提高免疫效果,增加养殖户的经济效益,我们采取了2-5倍剂量新城疫Ⅳ系活疫苗于第7d对不同实验组进行饮水免疫,分别于第7、14、21、283、5、42d采血并测量HI抗体效价,结果表明：4倍量饮水免疫效果最佳。