玛瑙红樱桃病毒病小RNA的高通量测序检测

为玛瑙红樱桃病毒病的防治与控制提供参考,采用第2代测序技术对玛瑙红樱桃黄化叶片进行小RNA测序,利用Velet对获得的小RNA进行组装,再将得到的重叠群(contigs)与数据库比对寻找其中的病毒序列。结果表明:贵州省玛瑙红樱桃纳雍县样本中的候选病毒库中,樱桃小果病毒2比对到的reads有6 014条,占总参考序列mapped reads的75.62%,其樱桃产区存在樱桃小果病毒2;在福泉、六枝产区未检出。贵州省玛瑙红樱桃部分产区存在病毒病,病原较单一,部分产区樱桃黄化症状不是由病毒引起。     

一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析

【目的】探究侵染掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）的大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）衍生的干扰小RNA（virus-derived small interfering RNA,vsiRNA）序列特征,为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。【方法】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为材料,取其褪绿斑驳的叶片采用TRIzol法提取总RNA,并进行小RNA深度测序（Small RNA Deep Sequencing）;利用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）和分段克隆技术获得病毒的全长基因组序列,利用MEGA 7.0将其与有代表性的病毒序列构建系统发育进化树并分析亲缘关系;以克隆测序获得的基因组序列作为参考进行vsiRNA特征分析。【结果】小RNA深度测序共获得4851249条高质量的读段（reads）,长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度,占比分别为33.4%、13.7%和11.3%。该病毒分离物的基因组全长为9735 nt,编码3105个氨基酸,其基因组全序列与SMV HZ1分离物核苷酸序列相似性为86.93%,暂命名为SMV NN;系统发育进化树显示,SMV NN与分离自半夏的SMV HZ1分离物的亲缘关系最近。将vsiRNA定位到克隆测序后获得的SMV NN的基因组上,分析该病毒的vsiRNA特征,结果发现长度为21和22 nt的vsiRNA具有较高的丰度,病毒全基因组的正链和负链均能被vsiRNA覆盖,且分别在HC-Pro和P3蛋白编码区具有最强热点。【结论】掌叶半夏主要通过dicer样核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4,DCL4）和Argonaute蛋白1（Argonaute1,AGO1）对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区进行剪切,主要产生长度为21和22 nt的vsiRNA,从而抑制SMV在植株体内的复制。     

贵州省纳雍县玛瑙红樱桃产业发展的思考

玛瑙红樱桃是1995年2月被发现的樱桃新品种,2011年11月通过贵州省农作物品种审定委员会审定,定名为玛瑙红。纳雍县经过二十年推广种植,产业已成规模。当前,毕节市委提出"决战贫困、提速赶超、同步小康"为统领的脱贫攻坚战略,因此抢抓发展契机,壮大玛瑙红樱桃产业,是纳雍县实现"三大主题"战略的重要举措,在纳雍县脱贫攻坚战中具有重要的战略意义。     

玛瑙红樱桃主要病虫害绿色防控

樱桃是经济价值和营养价值较高的水果。近年来,纳雍县玛瑙红樱桃的种植面积不断扩大,病虫害的有效防治对玛瑙红樱桃的质量和品质有较大的影响,做好病虫害的防治非常重要。本文对玛瑙红樱桃主要病虫害及其绿色防治方法进行总结,以期为果农提供有益帮助,促进增产增收。     

利用二代测序技术对柔嫩艾美耳球虫T-DNA整合位点的分析及鉴定

为建立一种适用于转基因球虫的快速且准确的分析T-DNA整合位点的方法，本研究利用二代测序技术对转基因柔嫩艾美耳球虫EtM2e虫株进行基因组重测序分析，基于嵌合体reads比对分析T-DNA的插入位点，通过T-DNA特有序列以及外源基因与球虫同源序列的测序深度进而分析T-DNA拷贝数，最后利用PCR扩增验证分析位点。结果表明:1)二代测序下机数据过滤后获得数据7.2 Gb，Q20为96.1%，Q30为89.2%，能够比对至柔嫩艾美耳球虫参考基因组的reads数为23 992 361×2，平均测序深度为80×，reads全基因覆盖结果表明整个染色体被覆盖的较为均匀，测序的随机性比较好，可以进行后续分析；2)比对至T-DNA序列的reads数为3 106和3 036，平均测序深度为140×，嵌合体reads序列信息表明T-DNA只存在一个插入位点，位于HG994969.1:2 704 213~2 705 255；3)T载体骨架特有序列卡那抗性基因的平均测序深度为67×，T-DNA特有序列EYFP基因的平均测序深度为85×，而T-DNA与球虫同源序列His4基因的5′调控区序列的平均测序深度为154×，Actin基因的3′调控区序列的平均测序深度为164×，同源序列的平均测序约为特有序列平均测序深度的2倍，这表明T-DNA为单拷贝，与发现一个插入位点的结果相符合；4)经PCR验证分析成功鉴定了该整合位点。转基因艾美耳球虫EtM2e虫株T-DNA整合位点的鉴定为后续转基因球虫鉴定提供了技术平台，也为球虫活载体疫苗的研发提供了一个潜在的靶位点。     

生物炭对玛瑙红樱桃土壤微生物和养分的影响

以贵州省主栽樱桃品种玛瑙红为试材,探讨生物炭对土壤微生物和养分的影响,旨在为玛瑙红樱桃的丰产优质栽培及生物炭在果树上的应用提供理论依据。试验设置0(CK)、5(C1)和10(C2)kg/株3个生物炭施用量,结果显示:在始花期,C1处理显著提高细菌、反硝化细菌数量,C2处理显著提高好氧固氮菌数量;在盛花期,生物炭的添加显著提高了土壤微生物多样性和反硝化细菌数量;在结果期,C2处理显著提高真菌数量;添加生物炭处理提高了土壤pH值和有机质含量,但对土壤养分的影响因物候期而异。结果表明,生物炭的添加能提高玛瑙红樱桃土壤微生物量、微生物多样性、土壤养分,但提高效果与植物所处生长状态有关。     

广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份，对采集的样品按照地区和症状进行分类，提取每份样品的总RNA，将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果，设计特异引物进行RT-PCR验证，从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒，根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物，通过优化反应体系和反应条件，建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中，共检测到12种病毒，按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒（Lagenaria siceraria alphaendornavirus,LSEV）(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）(62.8%)、...     

甘蓝花叶病病毒种类鉴定及BrYV遗传变异分析

为了明确引起甘蓝花叶病的病毒种类，利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）高通量测序技术，并结合分子生物学方法查找甘蓝样品中的病毒序列，发现存在芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus，TuMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、蚕豆萎蔫病毒2（broad bean wilt virus2，BBWV2）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和芸薹黄化病毒（brassica yellows virus，BrYV）等5种病毒。采用RT-PCR技术进行验证，结果显示样品检测到BrYV、TuMV和CMV共3种病毒。对获得的BrYV外壳蛋白基因（coat protein，cp）进行测序和系统进化分析，获得1条576 bp的BrYV cp基因全长序列，与GenBank中BrYV分离物cp基因核苷酸序列同源率为88.0%~96.4%，氨基酸序列同源率为90.1%~95.8%。基于cp基因序列构建系统发育树，BrYV-GL为BrYV-C基因型，与中国内蒙古油菜BrYV（GenBank登录号EF079907）分离物cp基因序列聚集在一起，亲缘关系较近。BrYV cp基因共检测到4个潜在重组事件，可为后续甘蓝花叶病的研究和防治提供参考。     

新疆吐鲁番地区三种甜瓜病毒病的发生与分子鉴定

[目的]明确吐鲁番地区西瓜花叶病毒(WMV)、小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)、南瓜蚜传黄化病毒(CABYV)的发生情况及三种病毒不同来源分离物间的遗传差异.[方法]采用分子检测方法,确定吐鲁番地区甜瓜CABYV、WMV、ZYMV的侵染比例,应用序列比对及构建系统发育树分析三种病毒,吐鲁番分离物与国内外其他分离物间遗传差异.[结果]吐鲁番地区40份病毒病样中WMV、ZYMV、CABYV分子检测阳性比例分别达87.5;、50;、30;.ZYMV吐鲁番分离物等部分国内外分离物NIB与CP蛋白之间存在蛋白切割位点Q/S,WMV、ZYMV吐鲁番分离物等部分国内外分离物DAG基序的氨基酸序列均为DAG.依据系统发育树分析将三种病毒吐鲁番分离物分别划分至不同的亚组.[结论]WMV、ZYMV为吐鲁番地区甜瓜病毒病的优势毒原,CABYV为吐鲁番地区甜瓜病毒病的主要病毒之一.CABYV、WMV吐鲁番分离物与国内部分省份分离物亲缘关系更近,ZYMV吐鲁番分离物XJturufan2与东欧、中东国家的分离物亲缘关系更近,ZYMV吐鲁番分离物XJturufan与国内部分省份分离物及美国、西班牙、日本等国分离物亲缘关系更近.     

上海地区葡萄病毒种类及传毒介体检测鉴定

2017—2018年对上海市嘉定区、宝山区、奉贤区、浦东新区葡萄种植园进行病毒病调查及传毒介体检测,将采集的叶片混合后通过小RNA测序方法确定侵染病毒种类。结果表明:混合样品带有葡萄双生病毒A(Grapevine geminivirusA,GGVA)、葡萄卷叶伴随病毒2(Grapevine leafroll-associated virus2,GLRaV-2)、岩生葡萄茎痘伴随病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFkV)和葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus,GFabV)等5种植物病毒;RT-PCR或PCR复验结果与小RNA测序结果一致。同时,对浦东新区葡萄园种植点周边的昆虫带毒情况检测发现,葡萄双生病毒A普遍存在于烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)、茶黄蓟马Scirtothrips dorsalisHood、狭领纹唇盲蝽Charagochilus angusticollis、菊方翅网蝽Corythucha marmorata(Uhler)、桃蚜Myzus persicae和寡脉蝇Asteia amoenaMeigen体内,此外在狭领纹唇盲蝽体内还检出GFk V,其他病毒未检出。该结果可为进一步研究上海地区葡萄上发生的病毒病种类及传毒介体提供参考。