真核表达载体pCDNA3-CaBP-D28k的构建及细胞表达

构建钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)真核表达载体,并证实了其在真核细胞COS-1中的表达情况,为进一步研究该重组载体在动物体内的表达奠定了基础。通过酶切方法自含鸡CaBP-D28k基因的克隆质粒pGEM-T-CaBP-D28k中扩增CaBP-D28k基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CaBP-D28k在COS-1中的表达。     

鸡CaBP-D28k基因重组质粒构建

    为构建pCEP4-CaBP-D28k真核表达载体,根据GenBank已发表钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)设计1对引物,利用RT-PCR方法获得新扬州鸡CaBP-D28k基因序列,克隆入真核表达载体pCEP4,经PEI介导转入非洲绿猴转化肾细胞(COS-1)中,并以间接免疫荧光试验(IFA)检测CaBP-D28k表达状况.结果表明,CaBP-D28k基因核苷酸长度为789 bp,编码261个氨基酸,与GenBank上已发表序列比较,核苷酸同源性为99.9%,在第760位处存在G→T的错义突变.该序列与蟾蜍、鼠、人CaBP-D28k氨基酸同源性分别为79.7%、78.2%、78.6%;酶切和测序鉴定证实pCEP4-CaBP-D28k含有目的片段,且连接构建正确;在COS-1细胞中检测到CaBP-D28k表达.这为进一步研究pCEP4-CaBP-D28k在动物体中的表达,调控机体钙代谢奠定了基础.     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。     

新城疫病毒F基因真核表达载体的构建及瞬时表达

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。     

乳酸克鲁维斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表达

从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达载体pET-30a( )上构建重组表达质粒pETlac4。将pETlac4电击转化到大肠杆菌BL21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3h后的蛋白表达情况。表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,k／ac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0、475U／mL,37℃仅为0．134U／mL。     

高原鼠兔HIF-1α基因真核表达载体的构建及细胞表达和定位

利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构建的pcDNA3.0/6Xmyc-pHIF-1α真核表达载体序列正确;HIF-1α在真核细胞中能够正确表达,且其表达产物主要存在于细胞核中。     

乳酸克鲁维斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表达

从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k 538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达栽体pET -30 a(+)上构建重组表达质粒pETlac 4.将pETlac 4电击转化到大肠杆菌BL 21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3 h后的蛋白表达情况.表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475 U/mL,37℃仅为0.134 U/mL.     

钙结合蛋白d28k基因在鸡子宫中表达变化的研究

[目的]研究鸡子宫中钙结合蛋白d28k基因的变化规律。[方法]采集不同产蛋阶段蛋鸡的子宫组织，利用RT-PCR方法检测钙告合蛋白d28kmRNA在子宫的表达情况。[结果]蛋进入子宫前2、1h检测到钙结合蛋白d28k的表达，随着蛋壳的形成和钙化程度的慨龟。蛋进入子宫后5、15h钙结合蛋白d28k的表达量逐渐增加，在蛋进入子宫后15h达到最高水平，在产蛋后1、2h没有检测到该基因的表达。[结论]钙结合蛋白d28k是影响蛋壳钙化的重要基因。     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。     

REV囊膜糖蛋白基因真核表达载体的构建

根据禽网状内皮组织增生症病毒属(REV group)鸭脾坏死病毒株(SNV)囊膜糖蛋白基因的序列，设计和合成1对引物，以SNV株前病毒cDNA全基因组克隆为模板，通过：PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白(env)基因；将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1／Zeo( )中；将重组质粒转染到宿主细胞COS-7细胞中，通过间接免疫荧光试验(IFA)，证明该基因在宿主细胞中得到表达。