稻米直链淀粉含量的分子检测技术

由Wx基因编码的颗粒结合淀粉合成酶控制直链淀粉含量的合成。在Wx基因的 5′端引导区存在一个单核苷酸多态性位点。对 4 2份非糯性的籼稻和粳稻材料的多态性分析结果表明 ,利用分子标记技术可以区分开高直链淀粉含量和中低直链淀粉含量的品种。同时对其在育种实践中的应用进行了探讨     

籼型水稻突变体MLA-1低直链淀粉突变基因遗传分析

通过对籼稻美香占经空间诱变筛选出的低直链淀粉含量突变体MLA-1进行遗传分析及分子生物学研究,发现MLA-1与高直链淀粉含量材料杂交的F2籽粒群体直链淀粉含量呈现一对等位基因3:1分离模式,且低直链淀粉籽粒均表现为半透明胚乳性状,F2代植株中低直链淀粉含量植株、中等直链淀粉含量植株及高直链淀粉含量植株的分离比例为1:2:1;而MLA-1与糯稻“荆香糯“杂交的F2代单株自交穗出现糯粒穗、杂合(糯粒和半透明粒)穗及半透明籽粒穗三种类型,比例为1:2:1.选用180对微卫星引物对MLA-1和对照美香占进行SSR分析,有22.8%的扩增产物在两个材料间表现出了多态性,第6染色体短臂上与Wx基因紧密连锁的引物RM190附近的连续3对引物(RM587,RM510,RM584)均表现出多态性,这可能正是MLA-1直链淀粉含量降低的原因.根据以上结果,推测MLA-1的低直链淀粉含量突变基因为一隐性突变,该突变位点不但与Wx基因紧密连锁,而且与Wx基因共同控制MLA-1低直链淀粉含量和半透明胚乳特性.     

氮素和Wx基因缺失对小麦淀粉生物合成的影响

【目的】通过不同氮素施用水平,明确氮肥水平及灌浆时期对小麦Wx近等基因系籽粒淀粉含量的影响。【方法】以宁麦14为背景的8个小麦Wx近等基因系为材料,不施底肥、在三叶期追施0、150、300、450、600kg/hm~2的尿素作为氮素梯度,测定灌浆7、14、21、28、35 d的小麦籽粒直链、支链淀粉和总淀粉含量。【结果】Wx基因型、灌浆时间对小麦籽粒的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量产生显著影响,而氮素水平未引起淀粉含量及成分产生显著变化;淀粉合成在花后10 d以后极大加快、而到灌浆结束又明显趋缓。【结论】3个Wx基因直链淀粉的合成能力Wx-B1Wx-D1Wx-A1,其中Wx-D1和Wx-A1基因的综合作用与Wx-B1基本相当。     

杂交水稻骨干亲本Wx基因第一内含子+1位碱基多态性分析

【目的】直链淀粉含量是影响稻米品质的重要因素,而编码颗粒结合型淀粉合成酶(granule-bound starch synthetase,GBSS)的蜡质基因(Wx)是影响直链淀粉含量的主效基因。本研究拟分析120份杂交水稻亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基的多态性,以期研究其对内含子的剪接效率及Wx的表达的影响,为亲本育种筛选提供理论参考。【方法】选取120份水稻亲本材料,采用CTAB法提取基因组DNA,并以此为模版PCR扩增Wx基因片段;采用限制性内切酶Acc I对PCR产物进行酶切分析,根据琼脂糖电泳结果分析Wx基因第一内含子+1位碱基类型;同时测定其中19份亲本的直链淀粉含量、胶稠度和碱消值。【结果】PCR扩增结果显示所有材料中均可扩增出清晰且单一的目的条带;PCR产物的Acc I酶切分析结果显示,其中81份亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基是T,即为T型,占总数的67.5%,38份亲本为G型,占总数的31.67%,而仅有1份亲本为杂合型,即GT型,占总数的0.83%。19份亲本的直链淀粉含量测定结果表明,7份G型亲本的直链淀粉含量比12份T型亲本的高,且其中6个G型亲本的直链淀粉含量平均值均超过20%。另外,测定结果表明T型亲本和G型亲本的胶稠度和碱消值差别不明显。【结论】120份杂交水稻骨干亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基类型测定结果表明,与T型亲本相比,G型亲本的直链淀粉含量明显较高,而胶稠度和碱消值没有明显差别。     

小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-A单核苷酸多态性分析及其定位

 【目的】小麦果聚糖合成酶基因6-SFT是果聚糖合成过程中的关键酶基因,研究6-SFT-A的多态性,分析其与小麦苗期抗旱性的关系,并进行遗传定位。【方法】以苗期抗旱性不同的30份六倍体小麦和4份小麦A基因组供体种乌拉尔图小麦为材料,通过直接测序分析6-SFT-A的单核苷酸多态性（SNP）及其与抗旱性的关系;开发基因分子标记,利用RIL群体（偃展1号×内乡188）对该基因进行遗传定位。【结果】在30份六倍体小麦材料中检测到14个核苷酸多态性位点,包括13个SNP和1个InDel,平均234 bp检测到一个多态性位点,仅在1 727和1 781 bp 2个位点检测到非同义突变;在4份乌拉尔图小麦中检测到28个SNP和4个InDel,其频率明显高于普通小麦。该基因的内含子1、2、3和外显子3为变异富集区,其它区域变异较小,外显子2变异最小,π值为0。34份材料分为3种单倍型,HaplⅠ主要包括中等抗旱材料和水敏感材料,Hapl Ⅲ中主要包括强抗旱材料和中等抗旱材料。利用RIL群体将该基因定位于染色体4A的标记Xcwm-27与Xwpt688之间,遗传距离分别为5.3和7.9 cM。【结论】单倍型分析表明,小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-A单倍型与小麦苗期抗旱性有一定的相关性。     

Wx蛋白缺失对淀粉理化特性和面条品质的影响

 【目的】对Wx蛋白缺失影响小麦淀粉理化特性和面条加工品质的情况进行探讨。【方法】以6类Wx蛋白组成的14个品种为试材，测定其淀粉理化特性和面条品质，进行统计分析。【结果】Wx亚基的数目对其酶蛋白和直链淀粉含量有显著影响，随着Wx亚基数目的增加，Wx蛋白和直链淀粉含量相应升高，面粉膨胀势和峰值粘度呈现下降的趋势，但面条品质的变化并不表现完全一致。糯小麦绝大部分淀粉理化指标显著较低。不同Wx亚基对淀粉理化特性和面条品质的影响也存在一定的差异，缺失Wx-B1亚基对直链淀粉合成的影响最大，其次是Wx-D1亚基，缺失Wx-A1亚基作用最小。3类单一Wx亚基缺失材料中，Wx-B1亚基缺失品种直链淀粉含量最低，膨胀势和RVA峰值粘度最高，面条评分最高。【结论】从不同Wx亚基缺失类型小麦品种看，面条评分与直链淀粉含量、膨胀和糊化特性之间并不是简单的直线关系，尤其是直链淀粉含量，而是有一个合适的范围，在这个范围内随着直链淀粉含量的下降，膨胀势和峰值粘度升高，面条评分上升，超出这一范围面条评分下降。     

宣和猪PLIN2基因5′-UTR和3′-UTR多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】揭示PLIN2基因对宣和猪生长性状的影响。【方法】以357头宣和猪为试验材料,采用PCR产物直接测序法检测了PLIN2基因的5′-UTR和3′-UTR多态性,分析了各SNP位点不同基因型的生长性状差异。【结果】在5′-UTR检测到2个SNP位点(G158A、T491G)、3′-UTR检出1个SNP位点(G5689A),上述3个SNP位点分别以GG、TT和GG基因型频率最高,G、T和G为优势等位基因;除G158A位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P0.01)外,其余2个突变位点均处于平衡状态(P0.05),且杂合度较高、遗传多样性较为丰富。在6月龄体重、4—6月龄日增重和70日龄—6月龄日增重上,G158A位点的GG型、T491G位点的TT型和G5689A位点的GG型均显著高于同位点其他基因型(P0.01或P0.05);且3个SNP位点不同单倍型组合对生长性状的影响呈现了明显的协同作用,即GTG/GTG组合的6月龄体重、4—6月龄日增重和70日龄—6月龄日增重最高(P0.01或P0.05)。【结论】研究结果从PLIN2基因多态性角度印证了宣和猪新品种选育工作的有效性,初步证实PLIN2基因与宣和猪生长性状间存在显著关联。     

Wx蛋白组成对小麦籽粒淀粉合成的影响

 【目的】通过对籽粒淀粉积累和淀粉合成关键酶的活性进行比较,初步明确不同Wx蛋白组成小麦品种淀粉理化特性差异的酶学基础。【方法】以6类Wx蛋白组成的14个小麦品种为试材,测定其籽粒灌浆过程中直、支链淀粉积累动态和4种淀粉合成关键酶的活性变化,对测定结果进行统计分析。【结果】Wx蛋白数目和类型对4种淀粉合成关键酶活性和直、支链淀粉合成有明显影响。随着Wx蛋白数目的增多,4种淀粉合成关键酶活性呈现升高的趋势,尤其是淀粉粒束缚淀粉合成酶（GBSS）,籽粒直链淀粉含量也相应升高。Wx-B1缺失蛋白对GBSS活性影响最大,直链淀粉合成能力下降最明显,其次是缺失Wx-D1蛋白,Wx-A1蛋白缺失作用最小。籽粒灌浆过程中,4种淀粉合成关键酶活性高度相关,并与直、支链淀粉含量密切相关,说明直、支链淀粉的合成是相互影响、相互制约、同步进行的。【结论】Wx基因是影响籽粒直链淀粉含量的重要决定因素,Wx基因可以通过自身数目和组成的变化,控制GBSS的活性,并对其它淀粉合成关键酶的活性产生影响,最终影响直、支链淀粉的合成,形成不同的淀粉理化特性和加工品质。     

玉米ae基因的单核苷酸多态性分析

纯合隐性基因ae对提高玉米籽粒中直链淀粉含量具有重要作用。本研究根据已知的玉米ae基因序列,利用Oligo6.0软件设计了23对特异性引物,对选育高直链淀粉玉米群体的亲本进行特异性PCR,对扩增产物进行测序,结果发现:在ae基因的9067bp序列中发现了48个单核苷酸多态性位点(SNPs)和31个插入/缺失(In Dels)位点,单核苷酸多态性频率是1个SNP/188bp和1个In Del/292bp。     

苦瓜MAP30基因克隆与单倍型分析

【目的】以揭示苦瓜MAP30完整基因结构及单倍型为目的,为研究MAP30基因表达调控机制提供参考。【方法】以34份苦瓜初级核心种质为材料,参考苦瓜基因组序列,克隆MAP30基因,利用多种生物信息学软件分析苦瓜MAP30完整基因结构及单倍型。【结果】苦瓜MAP30基因全长920 bp,包括52 bp的5′-UTR,7 bp的3′-UTR,861 bp的ORF,无内含子序列,编码286个氨基酸。系统进化分析表明:MAP30蛋白与葫芦科其他植物的RIPs蛋白亲缘关系较远,MAP30蛋白在苦瓜属植物中保守性较强。通过比较34份苦瓜种质资源MAP30基因序列,共发现6个SNP位点,第1个SNP位于5′-UTR区,其余5个SNP位于编码区。SNP分组发现:34份苦瓜种质资源MAP30基因共存在3种单倍型。3种单倍型编码的氨基酸序列比对显示:共存在3个氨基酸变异位点,分别是第2位M/V、第69位R/H、第74位N/D,3个氨基酸变异位点分别对应于第2、3、4 SNP位点,第5、6 SNP位点并未引起氨基酸的改变。【结论】本研究克隆了MAP30完整基因结构并分析了MAP30蛋白与葫芦科其他植物的RIPs蛋白的亲缘关系,另外分析了不同苦瓜种质MAP30基因SNP分布情况及单倍型种类。     

小麦胚乳Wx蛋白缺失对籽粒淀粉含量的影响

旨在通过比较不同的小麦胚乳Wx蛋白亚基缺失类型材料籽粒的Wx蛋白总量支直链淀粉含量及总淀粉含量,明确胚乳Wx蛋白对支直链淀粉合成的作用。利用SDS-PAGE方法鉴定了13个品种Wx蛋白亚基组成,并测定了这些品种的Wx蛋白总量、直、支链淀粉含量及直/支比。结果表明,任何Wx基因缺失都会造成Wx蛋白合成数量的明显著减少,随着Wx基因不表达的数量增多,Wx蛋白合成的减少量增多;糯麦的直链淀粉含量最少。Wx蛋白含量与直链淀粉含量和直/支链淀粉含量之间存在极显著和显著的正相关,r=0.860 0,r=0.810 8;Wx蛋白含量与支链淀粉含量之间呈中度相关,r=0.402 7,这说明Wx蛋白总含量对直链淀粉含量的大小起到决定性作用,而对支链淀粉和总淀粉含量只有一定影响;通过操纵Wx基因可以改变籽粒胚乳中的直链淀粉含量和淀粉的直/支比,进而达到改进淀粉理化特性和加工特性的作用。     

稻米胚乳直链淀粉含量的基因剂量效应

用不同直链淀粉含量的品种杂交获得的 F_1、F_2及亲本为材料,测定了单个胚乳的直链淀粉含量,以研究稻米胚乳直链淀粉含量的遗传。结果表明,蜡质位点的遗传由1个主效基因控制,F_1和 F_2的直链淀粉含量存在 Wx 基因剂量效应,有2个 Wx 等位基因对直链淀粉合成起着不同的作用,分离世代出现超亲个体,说明还存在修饰基因作用。     

小麦不同Wx蛋白缺失材料及其F_1代糊化特性分析

分析了不同Wx蛋白缺失类型小麦材料及其F1代正反交种子的直链淀粉含量及淀粉粘度的理化特性。F1代种子的直链淀粉含量在糯麦和普通小麦的直链淀粉含量之间 ,非糯×糯类型的F1代比糯×非糯类型的直链淀粉含量高。糯麦与其它材料的粘度特性显著不同 ,F1代种子的峰值粘度低于普通小麦亲本。直链淀粉含量与峰值粘度、回冷值、低谷粘度和最终粘度呈正相关 ,而与糊化温度和峰值时间的相关关系不显著。     

水稻品种直链淀粉的积累特性与W_x蛋白的关系

本文研究了中国水稻品种直链淀粉的积累特性及其与W_x蛋白的关系。结果表明:非糯品种直链淀粉的含量随籽粒的发育而增加;糯性品种花后7～14天直链淀粉含量上升,以后渐渐降低。糯性品种缺乏W_x蛋白;非糯品种的W_x蛋白水平与直链淀粉含量呈很好的线性关系,W_x蛋白的出现和变化情况则因直链淀粉含量的不同而异,其变化主要是受W_x基因顺序表达的影响。     

小麦淀粉品质改良的综合标记辅助选择体系的建立

 综合运用常规育种技术和标记辅助选择 ,建立了细胞和个体水平 (花粉和籽粒染色、直链淀粉含量、膨胀势和RVA粘度参数 )、蛋白质水平 (Wx蛋白的SDS PAGE)、DNA水平 (Wx基因的STS标记和SSR标记 ) 3个水平的综合标记辅助选择体系 ,用于改良淀粉品质 ,培育优质面条小麦和糯性小麦。结果表明 ,利用花粉和籽粒染色、Wx蛋白电泳、Wx基因的STS标记和SSR标记可以选育糯麦 ;国内首次从 5个组合中选育出一批糯性小麦株系。建立了依膨胀势、直链淀粉含量、高峰粘度的面条品质评分的回归方程 ,给出了小麦面条品质育种早代的预测指标。对综合标记辅助选择体系的利用和糯性小麦的应用进行了讨论。     

2个低直链淀粉含量籼稻突变体的遗传分析

对2个空间诱变低直链淀粉含量籼稻突变体XLA-1和XLA-2进行了遗传分析和分子生物学研究.结果表明:XLA-1低直链淀粉遗传特性受2对隐性基因控制,这2对基因具有连锁关系和互补作用,任何1对基因隐性纯合都将导致直链淀粉含量降低;XLA-2低直链淀粉遗传特性受1对隐性主效基因控制,该基因可能为Wx的等位基因,同时受微效基因的修饰.XLA-1和XLA-2蜡质基因(CT)n微卫星多态性与糯稻相同,但其直链淀粉质量分数分别为14.42%和11.59%,说明除Wx基因外确实还有其他影响直链淀粉含量的遗传因素,这与遗传分析结果相符.     

Determination of Amylose Content and Its Relationship with RVA Profile Within Genetically Similar Cultivars of Rice (Oryza sativa L.ssp.japonica)

Anther culture pure lines with antisense Wx gene were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated co-transformation followed by anther culture in transgenic rice (Oryza sativa L.ssp.japonica).The antisense Wx transgenic pure lines were used to analyze the differences and the relationship between RVA eigenvalues among the lines with different amylose contents.77 pure lines of anther culture having antisense Wx gene were studied for the amylose content of its offspring cultivar,Wuyunjing 7.It was found that levels of amylose content were similar to the control in 19 lines (16.0%);1-5%lower than control in 50 lines,of which,within 11.0-13.9% in 40 lines;and 3.1-4.0% in 8 lines.The effect of the amylose content on RVA eigenvalue was analyzed through the RVA profile graphic comparison and test of significance for RVA eigenvalues.The analysis of RVA profiles with different amylose contents indicated that there were two kinds of RVA profiles within genetically similar cultivars.The lines with 3.1-4.0% of amylose content were distinctly different from other lines and conventional glutinous rice.The comparison of the similarity curve of RVA profile of the lines with different amylose contents showed that the lines with lower amylose content had a distinguished RVA profile with the curve increasing gradually,but not exceeding the first apex.The test of significance for eigenvalues of the RVA profile in the lines with different amylose contents indicated that there were five eigenvalues remarkably different among the lines with 3.1-4.0% of amylose content compared with other two groups.Further,there were three eigenvalues remarkably different among the lines with 11.0-13.5% of amylose content compared with control group.An optimized mathematical model,which characterizes the relationships between the amylose content and RVA eigenvalue,has been established in this study.From this model,it was clearly indicated that the parameters PeT and SBV were more related to amylose content.It was concluded that the differences in amylose content not only affected the eigenvalues of RVA but also caused different RVA profiles within genetically similar cultivars.The introduction of antisense Wx gene could lead to reduce the amylose content and lay theoretical foundation for quality improvement in rice breeding programs.     

Determination of Amylose Content and Its Relationship with RVA Profile Within Genetically Similar Cultivars of Rice(Oryza sativa L.ssp.japonica)

Anther culture pure lines with antisense Wx gene were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated co-transformation followed by anther culture in transgenic rice(Oryza sativa L.ssp.japonica).The antisense Wx transgenic pure lines were used to analyze the differences and the relationship between RVA eigenvalues among the lines with different amylose contents.77 pure lines of anther culture having antisense Wx gene were studied for the amylose content of its offspring cultivar,Wuyunjing 7.It was found that levels of amylose content were similar to the control in 19 lines(16.0%);1-5% lower than control in 50 lines,of which,within 11.0-13.9% in 40 lines;and 3.1-4.0% in 8 lines.The effect of the amylose content on RVA eigenvalue was analyzed through the RVA profile graphic comparison and test of significance for RVA eigenvalues.The analysis of RVA profiles with different amylose contents indicated that there were two kinds of RVA profiles within genetically similar cultivars.The lines with 3.1-4.0% of amylose content were distinctly different from other lines and conventional glutinous rice.The comparison of the similarity curve of RVA profile of the lines with different amylose contents showed that the lines with lower amylose content had a distinguished RVA profile with the curve increasing gradually,but not exceeding the first apex.The test of significance for eigenvalues of the RVA profile in the lines with different amylose contents indicated that there were five eigenvalues remarkably different among the lines with 3.1-4.0% of amylose content compared with other two groups.Further,there were three eigenvalues remarkably different among the lines with 11.0-13.5% of amylose content compared with control group.An optimized mathematical model,which characterizes the relationships between the amylose content and RVA eigenvalue,has been established in this study.From this model,it was clearly indicated that the parameters PeT and SBV were more related to amylose content.It was concluded that the differences in amylose content not only affected the eigenvalues of RVA but also caused different RVA profiles within genetically similar cultivars.The introduction of antisense Wx gene could lead to reduce the amylose content and lay theoretical foundation for quality improvement in rice breeding programs.