杜氏盐藻促有丝分裂活化蛋白激酶DsMAPK的原核表达及纯化（英文）

盐藻是研究植物耐盐机制的重要模式生物,而MAPK基因在植物耐盐分子途径中起重要作用。该试验通过PCR扩增Ds MAPK基因的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体p GS-21a,得到重组表达载体p GS-21a-MAPK。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用GSTSefinoseTMKit进行纯化,所得产物进行SDSPAGE和Western blot鉴定。结果表明,该试验成功构建了重组表达载体p GS-21a-MAPK,经IPTG诱导后表达的融合蛋白与预期相符,纯化后的上清蛋白经Western blot检测显示该融合蛋白能与抗GST单克隆抗体特异性结合,具有良好的免疫学活性,Ds MAPK的成功表达为进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

杜氏盐藻基因DsSP的克隆、分析和原核表达(英文)

[目的]克隆盐藻淀粉磷酸化酶基因,并初步分析其基本性质和表达蛋白。[方法]采用RT-PCR和RACE的方法克隆基因;生物信息学系统分析其性质;构建原核表达载PGS21a-DsSP转化于E.coli BL21表达蛋白,采用GST-SefinoseTMKit和Western Blot分别纯化、检测该融合蛋白。[结果]成功克隆出1种淀粉磷酸化酶(GenBank accession No.KF061044)命名为DsSP;分析得到了其基本性质并预测了该蛋白的亚细胞定位、二级结构和三级结构;该融合蛋白在上清和包涵体中均存在,且对上清蛋白成功纯化;Western Blot检测表明其在E.coli.BL21中成功表达。[结论]为进一步阐明DsSP的功能及作用机制奠定了理论基础。     

杜氏盐藻无菌体系的建立

为建立杜氏盐藻无菌培养体系,试验选用卡那霉素、头孢霉素、氯霉素、链霉素、潮霉素和氨苄青霉素6种抗生素,分别测试盐藻细胞的抗生素耐受性和对盐藻藻液的除菌效果。结果表明,盐藻对氯霉素耐受性低,对头孢霉素和氨苄青霉素的耐受性较高;氯霉素、头孢霉素和氨苄青霉素单独处理对盐藻藻液的抑菌效果明显,卡那霉素、潮霉素和链霉素单独处理的抑菌效果较差;抗生素组合处理对盐藻藻液的除菌效果更强;应用50μg/mL氯霉素、100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL头孢霉素组合,经3次除菌处理和5次继代培养,建立了盐藻无菌培养体系。     

杀虫双对杜氏盐藻生长和生理生化的影响

以一种具有环境耐性的单细胞绿藻杜氏盐藻Dunaliella salina作为受试生物,检测一种杀虫剂杀虫双的毒性作用,试验中检测了杀虫双对杜氏盐藻细胞生长、单细胞β胡萝卜素质量、细胞形态变化及超氧化物歧化酶(Super-oxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性的影响.结果表明,当杀虫双质量浓度小于0.5 mg.L-1时,细胞的毒性响应与对照的变化趋势类似.当使用1.0～4.0 mg.L-1杀虫双处理盐藻,处理初期细胞生长缓慢和单细胞β胡萝卜素质量降低,一段时间后恢复.当杀虫双质量浓度大于5.0 mg.L-1,细胞生长速度和单细胞β胡萝卜素质量都会一直降低直至检测不到.杀虫双对杜氏盐藻的10 d IC50为32 mg.L-1.试验发现在低浓度下杀虫双会刺激CAT活性的增长.     

不同浓度氮、磷对杜氏盐藻生长的影响

在实验室条件下,研究了不同氮（0、0.1、0.4、0.8、1.0、1.2 g/L）、磷（0、0.015、0.025、0.030、0.045、0.060 g/L）浓度下杜氏盐藻生长增殖的关系和特征,以及氮磷比（c（N）/c（P））变化等对该藻生长的影响。实验结果表明：杜氏盐藻对氮、磷有着较强的适应能力,浓度增大藻增长率增大,浓度继续增大反而抑制藻的增长,属于营养依赖型藻类。不同氮质量浓度梯度对杜氏盐藻生长具有显著性影响（P〈0.05）,但对杜氏盐藻生长率K的影响不显著（P〉0.05）,最适宜的氮浓度为1.0 g/L;不同磷质量浓度梯度对杜氏盐藻的生长和生长率K具有显著性的影响（P〈0.05）,最适宜的磷浓度为0.025 g/L。当c（N）/c（P）为40时,最适合杜氏盐藻的生长。     

拟南芥蛋白激酶 SnRK2．6的原核表达、纯化及活性分析

从哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana Columbia 0）中克隆 SnRK2·6[SNF1（su-crose non-fermenting-1）-related protein kinase 2·6]的完整编码序列（coding sequence,CDS）,构建该基因的原核表达载体,将其转化 BL21（DE3）,经表达纯化得到 SnRK2·6蛋白。激酶活性分析发现,原核表达纯化的 SnRK2·6有自磷酸化和磷酸化 MBP（myelin basin protein）的活性,为后续试验分析 SnRK2·6的功能奠定基础。     

凋亡素原核表达及纯化

为进一步研究凋亡素结构与功能和制备凋亡素单克隆抗体,本试验构建了凋亡素的原核表达载体pET-28a-VP3,并将该质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白.结果证明在E.coli BL21中正确表达了凋亡素,同时对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在1.4 kD处出现目的蛋白带与预期相符.     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

碘盐对杜氏盐藻生长和品质的影响

[目的]研究碘对杜氏盐藻生长及品质的影响。[方法]用不同浓度的KI、KIO3处理杜氏盐藻,检测叶绿素a、可溶性蛋白、β-胡萝卜素、内源碘含量以及藻干重的变化。[结果]0.5～5.0 g/L的KI均抑制杜氏盐藻的生长,0.5～5.0 g/L的KIO3不同程度地提高了杜氏盐藻中叶绿素a及可溶性蛋白的含量,增加了藻的干重。其中0.5 g/L的KIO3效果最明显,使叶绿素a和藻干重分别提高65%和42%。另外,KIO3处理也使藻细胞中β-胡萝卜素和碘的含量增高,0.5 g/L KIO3使β-胡萝卜素和碘的含量分别提高48%和430%。[结论]KI抑制杜氏盐藻的生长,KIO3不但能刺激杜氏盐藻的生长还能提高其内活性物质的含量。     

外源一氧化氮缓解盐胁迫下杜氏盐藻氧化损伤的初步研究

研究外源一氧化氮(NO)供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)缓解3.0 mol/L NaCl胁迫对杜氏盐藻的氧化损伤作用并探讨其初步机理。结果表明:与单独盐胁迫相比,添加低浓度的SNP(0.5μmol/L和1μmol/L)能促进杜氏盐藻的生长,显著提高其叶绿素含量,并增强了超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P<0.05)。其中,1μmol/L SNP处理24 h后SOD活性提高了1.6倍。此外,半定量RT-PCR结果显示,低浓度的SNP(0.5μmol/L和1μmol/L)对盐胁迫下杜氏盐藻Fe-SOD基因的转录具有促进作用,24 h时作用显著(P<0.05),表达量分别提高了21.18%和27.41%,而高浓度的SNP(50μmol/L)抑制Fe-SOD基因的表达,加剧了盐胁迫带来的氧化伤害。     

柽柳转录因子基因ThbZIP1的原核表达及重组蛋白纯化

柽柳是重要的抗逆植物,提取柽柳总RNA,克隆了柽柳的16.5 k D b ZIP转录因子基因Thb ZIP1,构建原核表达载体p GEX-Thb ZIP1,导入宿主菌获得重组菌株BL21-Thb ZIP1,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行重组蛋白r Thb ZIP1诱导表达。试验结果表明:IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导温度为37℃条件下,诱导4 h,大肠杆菌提取液提取50 min时,所获得重组蛋白r Thb ZIP1表达量最大,占总蛋白的76.42%;经过10%SDS-PAGE电泳检测,发现重组蛋白r Thb ZIP1主要以包涵体的形式存在;并利用电纯化法成功获得纯化的目的蛋白。     

鸡骨保护素（chOPG）的原核表达、纯化及抗体制备

【目的】骨保护素（OPG）是一种新发现能抑制前体破骨细胞分化及成熟破骨细胞活性的蛋白,本文旨在从体外扩增、表达鸡骨保护素（chOPG）蛋白,并制备其多克隆抗体,为深入研究它的生物学功能奠定基础。【方法】以体外培养的鸡胚成骨细胞中提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出chOPG基因,测序后克隆至原核表达载体pET-32a（+）,成功构建了原核表达质粒pET-32a（+）-OPG,重组质粒转化Rosetta-gami（DE3）pLysS,经IPTG诱导表达。【结果】表达产物经SDS-PAGE电泳,发现目的蛋白大小约为63 kD,占菌体总蛋白的11.9%,Western blotting分析显示,表达的chOPG蛋白具有良好的免疫反应性。用镍离子亲和层析的方法可获得纯化的蛋白,以纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价达到1﹕10240。Western印迹结果表明,该抗体可以和chOPG酵母表达产物特异性结合。【结论】成功地实现了鸡骨保护素在大肠杆菌中的表达,并获得其多克隆抗体。     

曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达

在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景。本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株。工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白。     

花生AhSOS2基因原核表达载体的构建及表达

SOS2(Salt Overly Sensitive 2)是植物中一类耐盐相关基因的统称,在植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本试验以花生AhSOS2基因全长cDNA为模板,经PCR扩增获得AhSOS2的蛋白编码区,将该区段与表达载体pET-28a(+)融合,构建获得原核表达载体pET-28a-AhSOS2,并进一步在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经1.0 mmol/L IPTG诱导后,获得一条约51 kD的融合蛋白条带,且随着IPTG诱导时间的延长,蛋白表达量逐渐提高,诱导8 h可获得较高的蛋白表达水平。     

硒对盐藻生长及抗氧化酶活性的影响

研究了不同浓度硒盐处理对盐藻(Dunaliella salina)生长的影响。结果表明,Na2SeO3在0.1~1.0mg/L的范围内,盐藻细胞生长良好,生长速率高于对照;而大于10.0 mg/L的Na2SeO3处理,生长速率低于对照,表明高浓度的硒抑制盐藻的生长。硒对β-胡萝卜素的作用效应表现为,在0.1 mg/L的Na2SeO3处理时色素含量最高。超氧化物歧化酶(SOD)活性对低硒浓度没有响应,但当Na2SeO3浓度超过10.0 mg/L时,其活性明显提高;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,在Na2SeO3浓度0.1~1.0 mg/L的范围内随着硒浓度的增加而上升,Na2SeO3浓度超过1.0 mg/L时,酶活性随着硒浓度的增加而降低。     

Myo5a特异性片段原核表达重组质粒的构建

为了构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,采用PCR扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。最后重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定完全正确。     

水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达

水稻类受体蛋白激酶Os ESG1在种胚中特异表达,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Os ESG1基因全长c DNA经XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切,与同样经双酶切的原核表达载体p ET-28a(+)经T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21。原核表达结果显示,Os ESG1可受1 mmol/L IPTG诱导表达,且蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加,诱导7 h后,蛋白表达至较高水平。对不同浓度IPTG诱导下的蛋白表达情况进行研究,结果显示,0.1 mmol/L IPTG对Os ESG1的诱导表达效果最好。     

盐藻中叶绿素的提取方法比较及条件优化

[目的]确定有效提取盐藻中叶绿素的提取方法并优化提取条件。[方法]在单因素考察乙醇提取盐藻叶绿素优化条件的基础上,通过正交试验确定乙醇提取盐藻叶绿素的最优条件。[结果]乙醇提取盐藻中叶绿素的最优条件为85%乙醇、提取时间12 min、提取温度40℃,总叶绿素的最高提取率为10.80 mg/g湿重,比丙酮提取盐藻中的叶绿素提高了15.5%。[结论]以乙醇为提取剂可从盐藻中提取更多的叶绿素,且安全、无污染、时间短。此结果可为利用乙醇提取和测定海生盐藻中的叶绿素含量或工业生产提取叶绿素提供试验依据和参考。