双重PCR法同步检测菜豆晕疫病菌和萎蔫病菌

为建立同步检测菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌的双重PCR方法,根据Gen Bank上公布的菜豆晕疫病菌arg K基因特异性序列设计1对特异性引物PSPF1/PSPR2,将设计的引物与已发表的检测菜豆细菌性萎蔫病菌特异性引物Cff F1/CffR2结合,经过条件优化,建立了双重PCR反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。结果显示,采用双重PCR体系,能从菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌基因组DNA以及人工模拟带菌大豆种子样品中扩增到特异性条带,表明本研究所建立的双重PCR检测方法能同时检测出菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌,可用于口岸进口大豆中2种检疫性细菌的检测。     

巢式PCR检测菜豆细菌性萎蔫病菌

为了实现对进口大豆样品中菜豆细菌性萎蔫病菌的快速检测,试验根据菜豆细菌性萎蔫病菌的REP-PCR扩增测序结果,设计了1条特异性引物Cff F11,与引物Cff FOR组合,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆细菌性萎蔫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR方法检测菜豆细菌性萎蔫病菌菌悬液时,其灵敏度达到3.1×103cfu·m L-1,比常规PCR灵敏度高1 000倍。制备带菌率为0.5%的大豆样品,用巢式PCR方法 1h内就可进行检测,检测时间大大缩短;在对实验室留存的100份进口大豆样品检测时,1份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明此份大豆样品中携带的病菌为菜豆细菌性萎蔫病菌。本试验所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆细菌性萎蔫病菌的检测。     

玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan 探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高，可以快速、直接检测植物病原菌的方法，将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序，根据该细菌与其他细菌菌株16S rDNA序列差异，设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针，除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外，还对假单胞菌属1个种，黄单胞菌属1个种，棒形杆菌属1个种，短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测．结果表明：只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，其他细菌和植原体都没有荧光产生．检测的灵敏度为10^4CFU／mL的菌悬浮液，相当于4个细菌细胞的基因，灵敏度高，也就是说，反应体系中只要有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到．相对灵敏度为10^7CFU／mL，而且整个检测过程只需2h，由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统，不用凝胶电泳，降低了污染．     

菜豆中两种重要检疫性细菌检测方法

对菜豆中两种重要检疫性细菌——菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌检测方法进行研究。比较菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌的检测方法,结果表明:环介导等温扩增方法应用于菜豆检疫性细菌检测,可实现快速现场检测,且特异性强,灵敏度高。对保障国家农业生产安全、保护我国农村菜豆种质资源的安全起到重要作用。     

菜豆萎蔫病菌的PCR检测技术

根据在GenBank已登录的萎蔫短小杆菌(Curtobacterium flaccumfaciens)的基因间重复序列，用DNAman5．0软件比较同源性，设计了一对引物CffF1和CffR2，并以菜豆萎蔫病菌的基因组DNA为模板进行扩增，得到了一段长280bp的PCR特异产物。参试的其他属如棒形细菌属(Clavibacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、拉氏杆菌属(Rathayibacter)、红球菌属(Rhodococcus)细菌和萎蔫短小杆菌的其他致病变种(Cur．f.pv．oortii、Cur.f.pv．poinsettiae、Cur．f.pv．betae)，以及其他植物病原细菌的基因组DNA均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高，在100Pg的基因组DNA浓度下仍能检测到很强的条带。     

香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉细菌性枯萎病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计并合成一对引物和一条具有稳定点突变特异性探针，建立了对香蕉细菌性枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。除烟草青枯病菌和马铃薯青枯病菌外，还对其它属细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明，只有香蕉细菌性枯萎病菌产生荧光，其它细菌都没有荧光产生。从而证明此方法特异性强，灵敏度高，适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。     

菜豆晕疫病菌环介导等温核酸扩增检测方法的建立

为了建立菜豆晕疫病菌的环介导等温扩增方法,本试验利用菜豆晕疫病菌arg K特异性序列设计环介导等温核酸扩增(LAMP)引物,进行反应条件和反应体系的优化,并进行特异性和灵敏度验证。特异性检测结果显示,5株菜豆晕疫病菌的LAMP产物呈阳性结果,而参试的其他病原菌不产生扩增反应。LAMP检测基因组DNA和菌悬液时,其灵敏度分别达到0.632×10-4ng/μl和7.3×102CFU/ml,该方法比常规PCR灵敏度高100倍。表明本研究所建立的LAMP检测方法简便、快速、准确、灵敏,可有效应用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。     

西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号，其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。     

利用双重PCR技术检测柑橘溃疡病菌

建立了柑橘溃疡病菌的双重PCR检测方法.根据柑橘溃疡病菌的基因片段OPM-12SCAR fragment(AF312370),设计特异性PCR检测引物,并结合rpf基因设计的引物对柑橘溃疡病菌和其近缘菌株、植物原性细菌的DNA进行了双重PCR检测方法的研究.该方法特异性强,菌液浓度检测灵敏度达到102CFU/mL,能够满足快速、准确诊断柑橘溃疡病菌的要求.     

玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术.[方法]利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)16S-23S序列设计LAMP(loop-mediated isothermal amplification)引物,建立玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系,并对反应条件进行了优化.[结果] LAMP在内引物、环化引物和外引物比为6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25山体系下64℃反应30 min为最佳反应条件,且LAMP引物能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn梯度性条带.以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模板检测LAMP体系的灵敏度,结果显示,LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.6CFU,比普通PCR灵敏度高100倍.[结果]LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好,在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大.     

菜豆细菌性萎蔫病菌传入中国的风险分析

从世界分布、主要寄主、经济重要性、传入可能性和风险管理难度5个方面对菜豆细菌性萎蔫病菌传入我国的风险进行评估。结果表明,该病菌是特别危险的有害生物。根据分析结果提出了非疫区输入、输出国应严格检疫、进境口岸加严检查等相应的风险管理措施。     

虾-鱼-蟹海水养殖池塘细菌数量动态及其与理化因子的关系

对广东省汕尾地区虾-鱼-蟹海水综合养殖池塘的水体和沉积物进行每14 d一次的周期性采样,研究异养细菌、弧菌、芽孢杆菌和粪大肠菌群的变动规律及其与常见理化因子的关系.结果发现,水体环境中各类细菌的数量波动范围为:异养细菌6.4× 103～3.00× 105 CFU/mL,弧菌0.1×103～1.65×104 CFU/mL,芽孢杆菌0.06×103～1.09× 103 CFU/mL;沉积环境中各类细菌数量的波动范围为:异养细菌5.8×105～2.95×107 CFU/g,弧菌0.8×104～2.75×105 CFU/g,芽孢杆菌6.1×104～5.30×106 CFU/g.水体环境异养细菌与沉积环境异养细菌具有显著的线性正相关关系(P＜0.05),水体环境异养细菌和芽孢杆菌与水温呈线性正相关,但相关性不显著;芽孢杆菌与DO具有显著的线性正相关关系;弧菌与DO具有线性的负相关关系,但不显著.     

从叶片侵入的大白菜软腐病菌在植株内的系统侵染

对近200株3—6叶期的大白菜分别进行注射接种和破伤接种,结果从植株未接种的其它部位均回收到病原细菌,含菌量为10~3——10~7CFU/克鲜组织,且以接种叶叶柄的含菌量为最高,均在10~6CFU/克以上。当4株幼苗同时生长在一个盆钵中,对其中一株的叶片进行接种,从其余3株各部位也分离到病原细菌,第3天组织含菌量为10~2—10~4CFU/克,并以根部为最高,在10~5CFU/克以上。病原细菌从叶片侵入后,可在整个生育期的大白菜组织内回收到。幼苗期伤口接种通常并不引起显著病变。     

猕猴桃细菌性溃疡病可视化LAMP检测方法的建立与应用

为了建立能够广泛应用于田间的猕猴桃细菌性溃疡病快速检测技术,参考国外经验,设计并优化LAMP反应的检测体系,并可将检测结果可视化;同时,测试评价优化后的检测体系的灵敏性及特异性;通过采集猕猴桃不同部位的组织样品,验证优化后的检测体系的田间实际应用效果。结果表明:该方法能够特异性地检测出Psa病原菌,检测灵敏度达到100 CFU/mL。经对田间样品检测测试,表明该方法田间应用效果好。     

梭子蟹乳化病的间接ELISA诊断

以梭子蟹乳化病的病原菌-溶藻弧菌为抗原,制成免疫血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗、建立了检测溶藻弧菌的间接ELISA快速诊断法。结果表明,应用间接ELISA技术检测溶藻弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为104cfu/mL。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。人工感染试验48 h后,就能在血淋巴和鳃中检测到溶藻弧菌。应用建立的间接ELISA法进行现场检测,表观有病蟹的阳性检出率为90%,表观健康蟹的阳性检出率为20%,养殖海水中没有阳性检出。     

梭子蟹乳化病的间接ELISA诊断

以梭子蟹乳化病的病原菌-溶藻弧菌为抗原,制成免疫血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗、建立了检测溶藻弧菌的间接ELISA快速诊断法。结果表明,应用间接ELISA技术检测溶藻弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为104cfu/mL。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。人工感染试验48 h后,就能在血淋巴和鳃中检测到溶藻弧菌。应用建立的间接ELISA法进行现场检测,表观有病蟹的阳性检出率为90%,表观健康蟹的阳性检出率为20%,养殖海水中没有阳性检出。     

土壤及潜伏期桉树组织内青枯菌的PCR检测

为早期发现桉树幼苗和土壤带菌情况,本试验利用PCR技术对桉树林地土壤及潜伏期桉树青枯菌的检测进行了研究。结果表明:通过SDS法与简单提取法提取土壤中青枯菌DNA,PCR检测灵敏度均达2.5×104CFU/g,简单提取法与SDS法相比具有快速、成本低廉等优点;CTAB法提取人工接菌的桉树组织中青枯菌,PCR检测灵敏度达3×102CFU/g。利用浸泡法处理1年生桉树茎段,用1×107CFU/mL菌悬液处理后,第4天开始发病,至第8天发病率达100%,利用该数据得到了一种制备桉树青枯病潜伏期材料的方法,通过CTAB法提取潜伏期桉树青枯菌的DNA,利用OLI1和Y2引物进行PCR扩增后,检测出288 bp的条带。因此,PCR可以有效地检测土壤和感病潜伏期组织中桉树青枯病菌。     

用间接免疫荧光技术检测水稻细菌性条斑病菌的研究

本文报道了用于检测Xanthomonas campestris pv.oryzicola的间接免疫荧光技术。用兔抗X.c.pv.oryzlcola IgG处理标本,用羊抗兔免疫球蛋白荧光抗体染色,在荧光显微镜下观察。来自四川7个有代表性的X.c.pv.oryzicola菌株均为阳性反应,检测灵敏度为103～10~4个/ml。供试的X.c.pv.oryzae和X.1eersiae为阴性反应。检测四川40份稻种,选14份用间接法酶联吸附试验进行验证,结果趋向一致,证明间接法免疫荧光技术可以快速准确地检测稻种中的X.c.pv.oryzicola。     

黄瓜种子及幼苗内生细菌分离鉴定

分离不同品种黄瓜种子和幼苗中内生细菌,共得到79个菌株,经鉴定分属于芽孢杆菌属、土壤杆菌菌属、黄单胞菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属及短小杆菌属。内生细菌数量测定表明,不同组织中内生细菌的数量不同,根中最多,平均含量2.63×105CFU/g鲜组织,其次为茎,再次为子叶,种子中较少;品种间内生细菌优势种群结构相同,但细菌数量略有不同。