Streptomyces lavendulae X33海藻糖合酶基因克隆及酶学特性

[目的]海藻糖是一种由2个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键连接的非还原性双糖,在生物制品的保护剂方面具有良好的应用前景.海藻糖合酶(Trehalose Synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力.对链霉菌Streptomyces lavendulae X33中编码海藻糖合成酶的基因SlTs进行克隆,通过原核表达获得重组海藻糖合成酶,并研究其酶学性质.[方法]以Streptomyces lavendulae X33基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.重组蛋白经Ni-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响.[结果]从菌株Streptomyces lavendulae X33基因组中克隆得到了海藻糖合成酶基因片段SlTs GenBank登录号为MW217513.SlTs全长1719 bp,编码一个572个氨基酸的蛋白SlTs,分子量大小为66 ku.氨基酸序列分析表明SlTs与来源于Thermomonospora curvata DSM 43183的海藻糖合酶最高相似性为84％,与其它已报道的海藻糖合酶有较大差异.序列比对的结果显示SlTs与已解析结构的海藻糖合酶TcTs(PDB.5h2t)等具有的基序"DGGYD""NHTS""QPDLN""RXDAVPYL""LLAEANQ""LRNHDELTLE"高度保守,具有一个由Asp218-Glu260-Asp330构成的活性中心,表明SlTs归属于糖苷水解酶GH13家族.经异源表达,Ni2+-NTA亲合层析后进行纯化.重组酶rSlTs最适反应温度为20℃,最适反应pH为7.5,在以麦芽糖为底物,最适反应条件下测得的比活力为67.6 U/mg.重组酶rSITs在20℃下处理1 h活力不变,处理9 h时,残留酶活为60％.但在50℃下处理0.5 h活力丧失,表明rSITs对热敏感.重组酶rSITs在pH5.0～8.0有活性,最适反应pH为6.0,在pH6.0～7.0处理12 h活力稳定.1 mmol/L Ca2+对重组酶rSlTs有激活作用,Ni2+、Zn2+、Cu2+对重组酶rSlTs有抑制作用,其余金属离子对酶活无影响.甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rSlTs有显著抑制作用,TritonX-100对酶活无显著影响.[结论]首次从Streptomyces lavendulae X33中克隆得到海藻糖合成酶,并对其进行了酶学性质研究,为开发新的海藻糖合成酶提供理论基础.     

高温海藻糖合酶释放处理条件及其酶学性质的研究

[目的]对从Bacillus sp.SN02004-01菌所产高温海藻糖合酶产酶特性进行研究。[方法]通过试验研究了菌株细胞的破壁处理工艺及所得细胞海藻糖合酶性质。[结果]以2%甲苯＋0.2%EDTA为破壁试剂,菌体浓度0.05g/ml,温度为35℃,150r/min处理3.0h为最佳处理条件;该细胞酶最适反应pH值7.0,最适反应温度为60℃;Cu2＋、Zn2＋对该酶有抑制作用。[结论]在最佳处理条件下获得最高酶活为54.05u/ml,提高了2倍,说明该酶具有很好的生物反应特性。     

Bispora sp. MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究

酸性海藻糖酶作为生物催化剂在生物工业中广泛应用，挖掘酶学性质优良的酸性海藻糖基因具有重要意义。从Bispora sp. MEY-1中成功克隆出一个酸性海藻糖酶基因TreA，并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对纯化后的酸性海藻糖酶TreA进行酶学性质鉴定，其最适pH为4.0，在pH 2.2~5.0范围内，该酶能够维持60%以上的酶活力。TreA在偏酸条件下稳定效果比较好，在pH 1.0~4.0条件下处理1 h，可以剩余88%以上的酶活力。TreA的最适温度为60 ℃，在40~70 ℃之间都可以维持50%以上的酶活力，属于中高温酶。重组海藻糖酶TreA的比活为1 913 U·mg^-1，动力学参数Km和Vmax分别为0.67 mg·mL^-1和119 μmol·min^-1·mg^-1。同时，还评估了不同金属离子或化学试剂对纯海藻糖酶TreA的酶活性影响及其蛋白酶抗性。极大丰富了海藻糖酶基因资源，促进了其在生物工业中的应用。     

菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质研究

[目的]研究菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质。[方法]从一株碱性蛋白酶生产菌株I13中得到了碱性蛋白酶粗酶液,并研究了温度和pH对该酶液酶活力的影响。[结果]所产碱性蛋白酶的最适反应温度为40℃,在20~30℃范围内仍保持了最大活力的40%以上;最适反应pH为10.5,在pH 8.0~11.0范围内保持了最大活性的90%以上,有较宽的pH谱。[结论]该碱性蛋白酶具有开发成为洗衣粉添加剂的巨大潜力。     

红薯淀粉发酵生产海藻糖研究

[目的]为海藻糖的科学生产提供参考。[方法]对以红薯淀粉为原料发酵生产海藻糖的过程进行研究,通过正交试验确定海藻糖合成酶产生菌的最佳培养基配方,使用最佳培养基来确定最佳发酵时间、发酵温度、pH、装液量等最佳培养条件。[结果]以食尼古丁节杆菌为生产菌,得到海藻糖合成酶的产酶最佳培养基配方为：麦芽糖4%、蛋白胨0.5%、牛肉膏0.6%、K2HPO40.08%、NaH2PO40.12%。确定了以红薯淀粉为原料发酵生产海藻糖的培养条件为发酵时间48 h,最适发酵温度38℃,最适pH 7.0,最适装液量200ml/500 ml。[结论]确定了红薯淀粉发酵生产海藻糖的小试最佳培养基配方和发酵条件,为红薯淀粉发酵生产海藻糖后期的中试和工业化生产提供了科学依据。     

理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响

[目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase, EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖，在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景，其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造，以期获得热稳定性强的突变子，提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测，以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体，经大肠杆菌表达和蛋白纯化后，对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异，且最适pH值和最适反应温度也未发生改变；R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍；在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2...     

海藻酸钙固定麦芽寡糖基海藻糖合酶的研究

比较麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)与其固定化酶的最适反应pH值、pH稳定性、最适反应温度和热稳定性。结果表明,固定化酶的最适反应pH值(5.5)较原酶(6.0)低,最适反应温度(65℃)较原酶(60℃)高,pH稳定性和热稳定性均较原酶高。     

海藻酸钙固定麦芽寡糖基海藻糖水解酶的研究

研究了一种用海藻酸钙包埋麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalosetrehalohydrolase,MTHase)的固定化新技术,比较了原酶与固定化酶的最适反应温度、最适反应pH值和热稳定性。结果显示:固定化酶的最适反应温度和稳定温度都由原酶的60℃提高到65℃;固定化酶的最适反应pH值较原酶的5.5降低到5.0。表明MTHase的固定化能有效地提高它的耐热性及耐酸性。这对在未来的海藻糖工业生产中,降低微生物的污染和增加淀粉的溶解度,在更高的反应温度条件下进行海藻糖的合成,提供了一个新思路。     

水稻几丁质酶的表达及其酶学基本性质

利用甲醇诱导重组Pichia pastoris在发酵罐中表达几丁质酶,在发酵过程中根据溶氧变化控制甲醇流加速度.结果显示,蛋白表达量随菌体密度的增加而增加,酶活最高达56 U/ml.该几丁质酶具有良好的耐热性和pH适应性,在pH 2.0和pH 5.0有2个最适反应pH;在pH 3.0稳定性最好;40 ℃为其最适反应温度;在60 ℃保温3 h仍保持81%的酶活性;该几丁质酶对病原菌生长有一定程度抑制作用.     

轮纹大茎点菌葡糖淀粉酶部分酶学性质研究

轮纹大茎点菌在液体培养条件下产葡糖淀粉酶酶活很低,而在固态培养条件下酶活相对较高。对粗酶液中葡糖淀粉酶的部分酶学性质进行研究,结果表明,该酶的最适反应温度为50℃,30~50℃之间有较高活性;40℃以下稳定,50℃保温1 h酶活性损失60%以上。酶的最适pH为8.0,在pH 7.0~11.0之间有较高的酶活性:pH 5.0以下酶不稳定,活性迅速丧失,5.0~10.0之间酶相对稳定。K+、Fe2+、Ca2+对酶的活性基本没有影响,而Cu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Na+对酶的催化活性有激活作用,其中Mn2+激活作用最为强烈。     

推进农科教、产学研结合的探索与实践

文章针对高校推进农科教、产学研结合的难点问题,基于河北农业大学坚持走"太行山道路"的经验做法,探索了大力推进高校与地方政府、企业开展科技战略合作,创立服务地方经济建设的新模式,总结了以试验基地为载体,创新群体为骨干,构建农科教、产学研结合的创新平台,通过创新平台承担重大课题、出重大成果,培育区域支柱产业,创立现代农业先导型样板的经验,提出了加强政府引导作用、制定激励机制、建立技术创新和人才培养平台等推进农科教、产学研合作的意见和建议。     

困扰与惶恐：大卫·马麦特戏剧《美国野牛》的人性警示

大卫·马麦特的戏剧代表作《美国野牛》，以精妙生动的“马麦特话语”，凝练丰富的喜剧冲突，从语言与行动和事实、生意与人情人性、货币与商品及善恶等复杂关系的层面，形象地刻画了人物的矛盾纠结、困扰与惶恐。由此展现了现代美国人焦虑不安的经济生活和精神危机，暴露了现代美国社会伦理道德的沦丧，深刻揭示了人性的脆弱。其意义是，马麦特以反面警示的方式唤起人性中善的一面，即爱和信任；这也就是本剧人性关怀的现实主义主题所在。     

广西果蔬病虫无害化治理实践

介绍广西果树、蔬菜病虫害发生特点、防治以及防治效果情况,总结了5点经验:领导重视是保证;技术支撑是核心;示范样板建设是关键;机制创新是动力;群众广泛参与是基础。     

影视资源在高校思想政治教育中的价值和应用研究

党的十八大以来，习近平总书记高度重视高校思想政治工作。大学生是高校思想政治教育的主要对象，媒介尤其是影像媒介对大学生的影响日益突出。在高校思想政治教育中加强以优秀主旋律影视作品、校园院线等为代表的影视资源运用，是让思想政治教育深入学生生活、走进学生心灵的有效途径。高校思想政治教育应高度重视挖掘影视资源独特的"以文化人"价值，在高校思想政治理论课教学、课外隐性思想政治教育、校园文化建设等方面充分应用影视资源铸魂育人。     

魏晋南北朝时期农业科技文化的交流及其思考

魏晋南北朝时期是我国历史上的一个大动荡时期;同时,大动荡中也孕育着新的发展契机。这一时期,南北各地农业科技文化得到了广泛的交流与传播。南北农业科技文化的交流在微观上表现为农业生产工具的改进、作物品种的交流、北方旱田作物的南移、传统水利思想的继承以及精耕细作思想的传播等;在宏观上则表现为经济重心的南移、南方少数民族地区的跨越式发展和北方游牧民族的封建化。     

财经院校资环专业的办学困境及对策

基于财经院校资环专业及其与别的院校同一专业之间办学条件的对比分析,发现财经院校资环专业办学存在三大不足：目标定位不清,办学特色不明;实践环节不强,竞争能力不高;＂理财＂结合不紧,专业优势不彰。为此,财经院校的资环专业在办学上需要找准目标定位,优化培养方案;进行分类指导,优化课程体系;突出实践教学,加强校外交流。     

小麦种植管理及主要病虫防治技术

随着我国农业技术的发展,种植小麦涉及到越来越多的专业技术。本文主要是从种植小麦如何有效管理以及病虫的防治方法方面来进行研究的。     

果蔬传热传质研究进展

采后果蔬仍然具有生物特性,在贮藏或销售过程中会进行新陈代谢,这个过程伴随着热量交换和质量传递,研究该过程有利于掌握果蔬的品质变化规律,优化贮运设备.在阐述果蔬传热传质过程中水分迁移基本原理的基础上,综述了目前在果蔬传热传质研究上应用较广泛的方法,包括试验方法、数学模型方法和CFD方法,并分析比较了不同方法的特点.其中,试验研究具有准确、直观性强等特点,但往往需要投入较大的成本;数学模型方法为果蔬品质变化的预测提供了新途径;数学模型和CFD方法具有不受果蔬季节性限制等优点,但需对结果进行修正和验证.     

关于城乡建设用地增减挂钩的研究现状与思考

城乡建设用地增减挂钩对于集约节约利用建设用地、促进城乡统筹发展、合理布局建设用地等具有重要意义。为使该项工作更加科学合理地运行和发挥其作用,通过从政策制度、整理潜力分析、土地整理模式等方面对其进行总结研究,并结合城乡建设用地增减挂钩在实际实施中存在的问题,提出了相应的对策和建议,以促进增减挂钩工作的合理开展。