定量检测瘤胃纤维降解细菌的RT-PCR法

 【目的】建立一种适用于瘤胃主要纤维降解细菌的RT-PCR定量检测方法，通过培养技术监测瘤胃纤维降解细菌在不同环境下的数量变化，为深入研究反刍动物瘤胃发酵机理以及对纤维素资源的有效利用提供技术支持。【方法】分别以Fibrobacter succinogenes、Ruminococcus flavefaciens与Ruminococcus albus 的16SrDNA为靶序列设计相应的引物，建立SYBR GreenⅠRT-PCR定量体系。【结果】本研究所采用的引物及相应的PCR反应体系具有较高的特异性和灵敏度，检测极限可达50拷贝。采用RT-PCR方法检测瘤胃纤维降解细菌的定量结果与传统计数结果具有一致的变化趋势，相关性较高（r2=0.9591，P＜0.05），表明RT-PCR定量检测方法可以较为准确、迅速的检测绵羊瘤胃纤维降解菌群的数量随环境变化的情况。【结论】本研究所建立的RT-PCR检测方法能够较准确反映瘤胃纤维降解细菌数量的变化。     

秦川肉牛、荷斯坦牛及其杂交后代生长发育和产肉性能研究

【目的】分析比较秦川肉牛、荷斯坦牛及其杂交后代生长发育及产肉性能等经济性状。【方法】选择健康的6月龄秦川肉牛新品系公牛、阉牛、母牛(分别简称为秦川公牛、秦川阉牛、秦川母牛)、荷斯坦公牛、阉牛(分别简称为奶牛公牛、奶牛阉牛)和荷斯坦牛与秦川肉牛新品系杂交后代公牛、阉牛、母牛(分别简称为奶秦杂公牛、奶秦杂阉牛、奶秦杂母牛)各5头,共8组,进行18个月的标准化育肥,测定7~24月龄的体质量,每隔90d测定1次,计算平均日增质量;至24月龄屠宰实验牛并进行胴体分割,测定屠宰率、净肉率、胴体产肉率、肉骨比及各部位肉质量。【结果】各组试验牛在13~18月龄生长发育速度最快,荷斯坦牛生长发育速度较秦川肉牛和奶秦杂牛快。秦川肉牛的产肉性能明显优于荷斯坦牛,但与奶秦杂牛差异不显著。【结论】杂交改良牛既遗传了秦川肉牛优良肉质性能,也遗传了荷斯坦牛生长速度快的优点;秦川肉牛新品系已具备肉牛品种的基本特征;荷斯坦牛公犊经过育肥,也表现出良好的肉用性能。     

1—2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA转录水平的相对定量研究

【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。     

益生菌制品中植物乳杆菌ST-III快速定性、定量检测方法的建立

【目的】建立快速定性、定量检测益生菌产品中植物乳杆菌菌株ST-III的方法，为其实际应用提供参考。【方法】根据植物乳杆菌菌株ST-III与NCBI库中3株已知序列的植物乳杆菌全基因组序列差异，设计菌株特异性引物，进行菌株特异性PCR验证和定性检测；然后建立荧光定量PCR，并检测益生菌制品中菌株ST-III含量。【结果】设计的引物具有良好的菌株特异性；经PCR扩增，含有ST-III的检验样本出现预期特征条带，与预期目的片段（242 bp）相近。建立的荧光定量PCR标准曲线方程为y=-3.369lgx+39.84，R2为0.9990，符合Real-time PCR定量的要求，其检测限为2.85×103 CFU/mL。经检测，样品中植物乳杆菌ST-III的数量分别为3.25×105、1.28×106、4.55×106 CFU/mL。【结论】建立的植物乳杆菌菌株ST-III定性、定量检测方法快速灵敏、测定时间短，可以在实际生产中应用。     

柑桔黄龙病的常规PCR及荧光定量PCR检测

【目的】为柑桔黄龙病的早期诊断和寄主体内病原菌的动态监测提供一种稳定、可靠的检验检疫技术。【方法】利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因rplJ/rplL设计了2对PCR引物CQULA03F/CQULA03R、CQULA04F/CQULA04R和1条TaqMan探针CQULAP1，以此为基础建立了常规PCR和TaqMan探针法、SYBR Green I荧光染料法两种荧光定量PCR（共3种）反应体系；确定了3种体系各自的检测灵敏度、特异性和准确性，据此对3种体系进行了比较；从2004年7月到2005年5月还利用常规PCR和TaqMan探针荧光定量PCR体系完成了对柑桔黄龙病病原菌在寄主体内的周年变化的动态监测。【结果】两种荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少2～3个数量级，而TaqMan探针法由于使用了杂交探针，其特异性尤其可靠，另外两种定量PCR较小的产物片段使得它们具有更好的稳定性，加上荧光定量PCR方法本身受污染可能性小、操作简便等固有优势，使得前者更适合于柑桔黄龙病的检测。【结论】本研究建立的2种荧光定量PCR方法可以为柑桔黄龙病的病害早期诊断以及柑桔黄龙病病原菌近缘种的甄别提供准确、灵敏、快速的检验检疫技术。     

六个不同品种牛的瘤胃微生物群落的比较分析

分析不同品种牛的瘤胃微生物群落结构的差异,构建了1个鲁西肉牛瘤胃细菌16S rDNA文库,并从公共数据库中搜集来自荷斯坦奶牛、晋南牛、牦牛、黄牛和Hanwoo的9个16S rDNA文库,对序列多样性和文库组成等进行比较分析.结果发现:鲁西内牛瘤胃细菌16S rDNA文库共有122个克隆,可分为109个操作分类单元.文库中91%的克隆来自未培养细菌,拟杆菌(Bacteroidales)和梭菌(Clostridiales)是其中的优势菌祥.文库的定性和定量比较表明饲喂不同日粮的5个荷斯坦奶牛16S rDNA文库组成类似,而与鲁西肉牛等亚洲品种的文库存在显著差异.结果表明,牛的品种是瘤胃细菌群落差异的重要因素,对瘤胃细菌群落组成的影响大于日粮或其他因素.     

青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵及甲烷生成的影响

【目的】旨在研究青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵及甲烷生成的影响。【方法】选用4头体况相近、胎次相近的健康荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体。试验分为6个处理组,即在发酵底物中分别添加0.00%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、2.00%的青蒿提取物,每个处理组6个重复,试验重复进行3个批次。于39℃的恒温恒湿培养箱中体外发酵24h,测定瘤胃常规发酵指标pH、氨态氮、挥发性脂肪酸、总产气量及甲烷生成。【结果】与对照组相比,添加青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵液的pH、总挥发酸、乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、产气量均无显著影响(P0.05)。当添加0.50%和0.75%的青蒿提取物时,氨态氮质量浓度、干物质消失率显著提高(P0.05),中性洗涤纤维含量显著降低(P0.05)。青蒿提取物显著降低乙酸/丙酸值,且0.50%组的乙酸/丙酸值最低(P0.01)。青蒿提取物可有效抑制甲烷生成,0.50%时抑制效果最佳(P0.01)。【结论】在体外条件下,添加青蒿提取物可以有效调节奶牛瘤胃发酵,且添加0.50%青蒿提取物对奶牛瘤胃发酵及甲烷调控最适宜。     

实时荧光定量PCR技术在研究反刍动物消化道微生物菌群生态学上的运用

建立在以培养为基础的传统的估测瘤胃细菌的方法正在快速地被以核酸为基础的现代技术所取代。这些技术以SSUrDNA序列分析为基础，SSUrDNA序列分析提供了建立在系统发育树上的分类体系，用来记数和鉴定微生物菌群。最近包括PCR在内的许多分子生物学方法，提供了不依赖于培养的新技术，使人们对瘤胃微生物群落组成和丰度有了进一步了解。实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点，在瘤胃微生物生态学中逐渐得到广泛的应用。文章就利用实时荧光定量PCR技术定量瘤胃纤维分解菌和产甲烷菌的发展过程进行了报道。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立

 【目的】克隆猪cDNA，作为猪LPL mRNA定量检测的标准品，建立检测方法。【方法】用RT-PCR，从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA，将纯化的LPL cDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10，提取重组质粒DNA，PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR 检测。纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPL mRNA实时定量PCR检测方法，特异性好，检测灵敏度达103拷贝，线性范围为1×103 ～1×1010拷贝，阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2＝0.9871）。【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准，且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPL mRNA的表达进行准确定量。     

实时荧光定量PCR检测弓形虫GRA6基因方法的建立和应用

【目的】在建立快速且准确检测牛弓形虫病的实时荧光定量PCR方法,以进一步研究该病对奶牛的感染情况,为临床诊断与防控提供依据。【方法】以已发表的牛弓形虫GRA6基因作为检测弓形虫病的目的基因,对上述基因各设计一对引物和一条Taqman探针,该探针5'端用荧光基团JOE标记,3'端用Eclipse标记,进行单重荧光定量PCR。【结果】经反应条件的优化,建立了能够检测牛弓形虫GRA6基因的荧光定量PCR方法。该方法具有具有较好的特异性和可重复性,对GRA6基因的检测最低限为7×100copies/反应,是普通单重PCR的灵敏度的100倍。【结论】用该方法对58份临床样品进行检测,有12份样品存在弓形虫感染,阳性检出率为20.69%,可用来对弓形虫进行快速、准确的检测。     

蒙古绵羊瘤胃固、液相附着微生物的RT-PCR检测

 【目的】应用Real-time PCR（RT-PCR）对蒙古绵羊瘤胃内容物固、液相附着微生物的生态分布进行定量研究。【方法】采集3只蒙古绵羊瘤胃内容物,固液分离后对各相中所附着的微生物进行定量检测,包括总细菌、总厌氧真菌和3种主要纤维降解菌－白色瘤胃球菌Ruminococcus albus、黄色瘤胃球菌Ruminococcus flavefaciens、产琥珀酸拟杆菌Fibrobacter succinogenes。【结果】固相中总细菌、总厌氧真菌和3种纤维降解菌的16S或18S rRNA 基因考贝数显著高于液相,分别是液相附着微生物的7.22倍（P＜0.05）、56.85倍（P＜0.01）、2.69倍（P＜0.05）、4.19倍（P＜0.01）和7.59倍（P＜0.01）。瘤胃固相中F.succinogenes 菌的丰度为0.55%,高于R.flavefaciens 菌（0.53%）和R.albus菌（0.09%）。瘤胃液相中R.flavefaciens菌的丰度最高,为0.91%,高于F.succinogenes菌（0.52%）和R.albus 菌（0.24%）。【结论】RT-PCR方法能够准确对瘤胃固、液相附着微生物进行定量分析。     

双峰驼瘤胃微生物总DNA的提取与纯化

【目的】提取高质量的双峰驼瘤胃微生物总DNA,为采用免培养技术研究双峰驼瘤胃微生物奠定基础。【方法】采集双峰驼瘤胃内容物,用酶解(溶菌酶、蛋白酶K)、冻融和表面活性剂十二烷基磺酸钠(sodiumdodecyl sulfate,SDS)、溴化十六烷三甲基铵(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide,CTAB)多种处理相结合,提取微生物总DNA,并用Omega Gel Extraction kit纯化。【结果】提取到的瘤胃微生物总DNA片段大于23 kb,纯化后的DNA可用于PCR,酶切及克隆等进一步的分子生物学研究。【结论】用该提取方法得到的总DNA能够满足分子生物学试验的要求。     

应用DGGE分析秸秆日粮对奶牛瘤胃细菌群落的影响

【目的】通过与苜蓿日粮比较,揭示秸秆日粮模式下瘤胃固液相细菌群落的独特结构。【方法】选择12头健康且体重相似的装有永久瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,分别饲喂以玉米秸秆（CS）和苜蓿、羊草、青贮玉米三者混合物（MF）为粗饲料组成的日粮,正饲期第13周连续3 d分12个时间点采集瘤胃固、液相内容物样品。提取微生物DNA后,利用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）分析细菌群落结构,并进行聚类分析及差异条带的测序分析。【结果】与MF组相比,CS组奶牛瘤胃固、液相细菌DGGE图谱条带的数目和光密度均有一定差异,两处理组都各有一些稍显优势的条带,CS组优势条带要少于MF组。与MF组相比,CS组液相细菌的香浓多样性指数无差异（P＞0.05）,固相细菌香浓多样性指数显著降低（P＜0.01）;通过对差异条带进行测序,发现与MF组相比,CS组中瘤胃细菌Prevotella sp.、Acetivibrio ethanolgignens和Clostridium sp.减少,并且大量来源于Bacteroidetes、Firmicutes、Tenericutes和Proteobacteria等菌门的未培养细菌有所变化。【结论】秸秆日粮条件下奶牛瘤胃存在独特的细菌群落结构,细菌多样性较低。     

昌吉地区荷斯坦牛年龄对体尺体重的影响

【目的】分析荷斯坦牛年龄与体尺、体重之间的关系,了解荷斯坦牛年龄与体尺体重之间的相关关系,从而提高生产性能。【方法】通过对昌吉地区测定的2 934头不同年龄荷斯坦牛体尺体重的资料进行统计,用SPSS13.0软件进行单因素方差分析与Duncan氏多重比较分析。【结果】荷斯坦牛年龄对体尺、体重有显著的影响,而体尺体重与牛的生产性能有很大的相关性。【结论】荷斯坦牛在舍饲饲养管理条件下2~3岁时生长发育迅速,是牛生长发育的重要时期,到3岁时平均体重可达成年(按4岁为成年)牛体重的94%以上,体高、体长指标可达成年牛的97%以上。     

荷斯坦母牛TLR1基因多态性及其与体细胞评分关系

 【目的】阐明Toll-like receptor 1（TLR1）基因多态性与荷斯坦母牛乳房炎抗性之间的关系,为奶牛乳房炎抗性的标记辅助选择提供依据。【方法】采用PCR-SSCP和PCR-RFLP检测208头荷斯坦母牛TLR1基因多态性,用最小二乘法分析基因多态性与荷斯坦母牛体细胞评分（somatic cell score,SCS）的关系。【结果】TLR1基因mRNA序列中存在G1409A、A1475C、G1550A和G1596A 突变位点,其中G1596A突变使异亮氨酸变为缬氨酸;G1409A突变位点经BsiYⅠ酶切产生2种基因型AA和AB,频率分别为0.375和0.625,χ2检验表明荷斯坦母牛在该位点偏离Hardy-Weinberg平衡;AA和AB基因型SCS最小二乘均值差异不显著（P＞0.05）;A1475C突变位点经BstXⅠ酶切产生2种基因型CC和CD,频率分别为0.178和0.822,荷斯坦母牛在该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡;CC和CD基因型SCS最小二乘均值差异不显著（P＞0.05）;G1550A突变位点经BsiYⅠ酶切产生3种基因型EE、EF和FF,频率分别为0.236、0.370和0.394,荷斯坦母牛在该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡;EE、EF和FF基因型SCS最小二乘均值差异均不显著（P＞0.05）;G1596A突变位点经BclⅠ酶切产生3种基因型GG、GH和HH,频率分别为0.260、0.567和0.173,荷斯坦母牛在该位点处于Hardy-Weinberg平衡;HH基因型SCS最小二乘均值极显著低于GH基因型所对应的值（P＜0.01）,极显著低于GG基因型所对应的值（P＜0.0001）;GH基因型SCS最小二乘均值极显著低于GG基因型所对应的值（P＜0.01）。【结论】对奶牛乳房炎抗性,HH是最有利基因型,GG是最不利基因型,初步证明TLR1基因G1596A多态位点的H等位基因是提高奶牛乳房炎抗性的一个潜在的DNA标记。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR，为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961，gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物，从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化，并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时，其标准曲线呈良好的线性关系，溶解曲线表现为单一波峰，Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性，其他参试菌株均为阴性；可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA，敏感性是常规PCR的100倍；Ct值变异系数小于5%，重复性好；对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测，其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点，适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的SYBR Green I实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌(R.solani)、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)和禾谷镰孢(F.graminearum)等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×103copies/μL,real-time PCR的灵敏度可达到6.5×102copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。     

全棉籽替换TMR中部分精料对泌乳后期奶牛生产性能的影响

【目的】探讨全棉籽替换TMR(全价混合日粮)中精料对奶牛生产性能的影响。【方法】试验选用产奶量、膘情、胎次相近、泌乳后期健康的荷斯坦奶牛30头,褐牛25头。采用自身对照,对照期按牛场常规TMR饲喂奶牛,试验期在TMR中用2 kg全棉籽替换等量的精料饲喂奶牛,与对照期相比较。【结果】试验期乳脂率、乳糖率极显著地高于对照期(P0.01),荷斯坦奶牛和褐牛的乳脂率提高了9.09%和8.70%;荷斯坦奶牛和褐牛的乳糖率提高了2.82%和7.98%;试验期奶牛产奶量、干物质采食量、乳蛋白都有增高的趋势,但与试验期相比差异不显著(P0.05)。【结论】在奶牛泌乳后期,用2 kg全棉籽替换TMR中等量(2 kg)精料可以提高奶牛的乳脂率和乳糖率,但对体细胞数及其它乳成分的影响差异不显著(P0.05)。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列，设计并合成1对引物。通过常规PCR，扩增猪细小病毒VP2基因，并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中，构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化，建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板，建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，对临床60份疑似PPV病料进行检测，同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中，Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时，本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒，灵敏度达20 TCID₅₀/mL；在临床样品检测中，其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。