小型猪体细胞克隆试验

[目的]建立体细胞克隆小型猪的技术平台并了解克隆效率。[方法]运用体细胞核移植技术,以小型猪胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞,以体外成熟卵母细胞作为核移植受体细胞进行体细胞克隆猪生产,并利用STR序列对所出生的克隆猪进行个体识别。[结果]将重构胚胎移植到5头代孕母猪体内,其中一头代孕母猪成功产下2头克隆小型猪。经过个体识别试验证实克隆小型猪来自供核细胞,与代孕母猪无直接亲缘关系。[结论]克隆小型猪的成功出生表明所建立的技术平台适于小型猪的克隆。     

氧分压、培养基及生长因子对猪体细胞克隆胚胎体外发育的影响

【目的】建立高效的猪体细胞克隆胚胎的体外培养体系。【方法】比较了克隆胚胎体外培养过程中高、低氧分压（20% O2和7% O2）和2种培养基（NCSU-23和 PZM-3）及添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维促进因子（bFGF）对胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数的影响。【结果】（1）与高氧（20% O2）气相相比,低氧（7% O2）条件下NCSU-23显著提高了胚胎的囊胚率和细胞数（P＜0.05,13.7% vs. 8.2%;46.3 vs.31.0）,培养基PZM-3只能显著提高囊胚细胞数（P＜0.05,49.4 vs. 36.6）;（2）与NCSU-23相比,PZM-3无论在高氧还是低氧条件,囊胚率和囊胚细胞数都较高;（3）NCSU-23中添加10 ng•ml－1 EGF或bFGF对胚胎的囊胚发育率（P＜0.05,25.5%,31.7% vs. 15.1%）有显著提高,但不能提高囊胚细胞数。【结论】低氧条件有利于胚胎的早期发育;PZM-3无论在高氧还是低氧条件下,都是胚胎发育的一个效果稳定、高效的培养基;胚胎培养基中添加EGF或bFGF能提高胚胎的囊胚发育率。     

TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育影响

曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂.有研究表明TSA处理可以提高核移植胚胎的发育率.为探讨TSA对猪核移植胚胎发育的作用,试验重点研究了TSA浓度及处理时间对核移植胚胎体外发育的影响,同时也探索了TSA对不同供核细胞构建的重构胚体外发育的影响.结果表明,40 nmol·L-...     

Vc对猪体细胞克隆胚胎体外及体内发育的影响

[目的]提高克隆猪的大批量生产效率,优化体外与体内培养体系。[方法]将所获得的猪体细胞克隆胚胎用含不同Vc浓度的培养液培养,比较体外囊胚发育力和囊胚细胞数,筛选出合适的培养浓度,然后用此浓度培养后的胚胎进行体内手术移植,统计克隆猪的分娩率和产仔情况。[结果]克隆胚胎在激活后用40μg/m L Vc处理22 h,体外培养未显著增加囊胚率,但显著提高了囊胚细胞数。体内移植结果显示,添加Vc未提高妊娠率,但增加了窝均总仔数,克隆效率差异显著。[结论]Vc处理有利于增强体细胞克隆胚的体内和体外发育能力。     

绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚的构建及体外发育研究

【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。     

奶牛体细胞克隆胚体外生产的优化研究

为了优化奶牛体细胞克隆胚的体外生产,将细胞核移植的环节分别于37℃、38％、39℃下进行,结果显示,38％、39℃下能显著提高重构胚的囊胚发育率（P〈0．05）;将重构胚分别与鼠胚胎和奶牛胚胎混合培养,结果显示,奶牛胚胎显著促进了奶牛重构胚的囊胚发育率（P〈0．05）。     

猪体外受精胚胎、孤雌激活胚胎以及体细胞核移植胚胎的体外培养

【目的】本研究系统比较了体外受精胚（IVFEs）、孤雌激活胚（PAEs）以及体细胞核移植胚（NTEs）的发育率和囊胚质量，同时还比较了PZM-3和NCSU-23两种培养基培养对PAEs以及NTEs发育的影响。【方法】利用体细胞核移植技术、体外受精技术和孤雌激活技术分别生产猪的NTEs、IVFEs和PAEs，开展体外培养。【结果】（1）IVFEs、 PAEs 和NTEs的卵裂率分别为72.0％，66.0％和63.5％，各组间没有显著差异(P>0.05)；囊胚形成率分别为11.0％，22.6％和16.9％，也不存在明显不同(P>0.05)；然而，在囊胚质量，即ICM细胞数/总细胞数的比例上， IVFEs和NTEs均优于PAEs（0.448％，0.356％ vs 0.122％，P<0.05）。（2）对PAEs来讲，以PZM-3为基础培养基时囊胚率明显高于以NCSU-23为基础培养基时的处理组（35.4％ vs. 22.6％，P<0.05）；而对NTEs而言， 两种培养基在支持胚胎形成囊胚方面的效果相当（26.6％ vs. 21.1％，P>0.05），虽然PZM-3培养时胚胎卵裂率显著低于NCSU-23培养组（47.5％ vs. 63.5％，P<0.05）。【结论】（1）PAEs的囊胚质量在3种来源的胚胎中最差；（2）对PAEs理想的培养基，当用于NTEs培养时却不一定是最佳的选择。     

胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。     

猪体细胞胞质注射核移植研究

首例体细胞克隆动物“多利”羊诞生以来,各种体细胞核移植动物相继成功克隆,但其克隆效率很低（低于10％）以及大都表现出不同程度的器官衰竭或发育畸形等。猪体细胞核移植在异种器官移植和克隆性治疗上具有重大意义,但其克隆效率更低（1%-2％）。利用胞质注射技术对比不同供核细胞、是否经血清饥饿和不同时间段激活对重构胚发育的影响,在其重构胚卵裂率上,试验结果表明：颗粒细胞与胎儿成纤维细胞无显著差异（43．37％,45．98％;P〉0．05）;血清饥饿与否无显著差异（45．61％。50．71％;P〉0．05）;在核移植后1-3h和3-5h激活显著高于立即激活（51．82％,56．98％。8．51％;P〈0．05）。     

利用成年母兔耳部皮肤上皮细胞生产克隆胚胎的研究

本研究以成年母兔耳部皮肤上皮细胞为核供体，对兔体细胞核移植技术中融合、激活以及不同来源受体卵母细胞的选择等环节进行了研究，比较了不同电场强度对重构胚胎融合率、分裂率的影响。结果表明，细胞在培养10代后仍增殖旺盛，呈多角型，具典型的上皮细胞形态。     

PiggyBac Transposon Mediated Efficient eGFP Expression in Porcine Somatic Cells and Cloned Embryos

PiggyBac transposon has demonstrated its long-term and stable transposition on genomes of various species but lacking of the evidence on farm animal genomes. In this study, we constructed a piggyBac tr...     

体细胞克隆牛生产效率的影响因素

体细胞克隆牛生产效率受实验室环节和胚胎移植环节等多种因素的影响。依据前期试验结果,重点分析了胚胎移植数量、季节变化和胚胎移植受体牛生理状态等因素对体细胞克隆牛生产效率的影响。结果表明:移植2枚胚胎比移植1枚胚胎和3枚胚胎能获得较高的妊娠率和产犊率及较低的流产率;在春、夏和秋季(5~9月)进行胚胎移植的效果显著优于冬季(12~1月);A、B级黄体受体牛的妊娠率显著高于C级黄体受体牛的妊娠率。胚胎移植数量、移植季节和受体牛生理状况均能显著影响克隆牛的生产效率。     

猪体细胞核移植电融合参数的研究

试验旨在研究不同电融合参数(场强、脉冲时程)对猪核移植胚融合率及发育能力的影响。采用44～48h成熟培养的去核猪卵母细胞作为受体细胞,颗粒细胞为供体。结果表明,在20μs脉冲时程条件下,0.8kV·cm-1组融合率显著高于0.4、1.2、1.6kV·cm-1组(P0.05)。0.8、1.2kV·cm-1组卵裂率显著高于0.4、1.6kV·cm-1组(P0.05)。场强为0.8kV·cm-1条件下,20μs组融合率显著高于30、40、50μs组(P0.05)。卵裂率20、30μs组显著高于40、50μs组。根据试验数据,本试验室最佳融合电参数为:0.8kV·cm-1、20μs,1次脉冲。     

供核细胞来源对猪克隆胚胎发育的影响

为研究不同组织来源的供核细胞对猪体细胞核移植胚胎发育能力的影响,分别采用颗粒细胞、耳成纤维细胞和尾成纤维细胞作为供核细胞,移入体外成熟的猪去核卵母细胞中形成重构胚,培养后对比其卵裂率和囊胚率。结果表明：以耳成纤维细胞作为供核细胞的重构胚的囊胚率最高,为17．8％,显著高于颗粒细胞（11．4％）（P〈0．05）。在卵裂率方面,两者无显著差别,分别为65．6％和61．9Voo（P〉o．05）。猪尾尖成纤维细胞的发育能力最差,卵裂率仅为20．2％且未获得囊胚,与其它两组差异显著（P〈O．05）。因此,耳组织来源的成纤维细胞作为供核细胞组织来源丰富且细胞易于传代和保存,以此为供核细胞的重构胚发育能力强,适合作为供核细胞。     

延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的初步研究

为了优化体细胞克隆胚胎体外培养液,提高体细胞的克隆效率,以CRlaa+5% FBS+0.3%BSA为基础培养液,分别添加0、60、80、100和120 μmol/L H_2O_2观察延边黄牛体细胞克隆胚胎的氧化损伤情况和体外发育模式,并研究1、4和7 mmol/L GSH对延边黄牛重组胚的保护作用.结果表明:(1)添加0、60、80 μmol/LH_2O_2组卵裂率显著要高于100 μmol/L和120 μmol/L组(P<0.05),添加H_2O_2的组囊胚发育率显著低于未添加组(P<0.05);(2)随着H_2O_2处珲浓度的升高,重组胚发育速度增加,但是发育停滞现象也更明显;(3)在培养液中添加GSH后,1 mmol/L组卵裂率显著高于7 mmol/L组(P<0.05),与0和4 mmol/L组差异不显著(P>0.05),囊胚发育率显著高于其它组(P<0.05).可见,在体细胞克隆胚胎体外发育过程中H_2O_2对其具有氧化损伤作用,不利其体外发育,在培养液中添加1 mmol/L GSH对体细胞克隆胚胎的氧化损伤具有明显的保护作用.     

In Vitro Developmental Potential of Cloned Embryos Derived from Bovine Somatic Cells and Rabbits Oocyte

180 reconstituted embryos were produced by nuclear transplantation using bovine ear fibroblasts at G0 or non-G0 stage as donor nuclei and oocytes collected from superovulated multiparous or young rabbits as recipients. After cultivation in two kinds of medium M199+ 10%FBS or RD+ 10%FBS, 112 of them developed to 2-cell stage (62.2%) and 26 to morula stage (14.4%) and 20 of them eventually developed to blastocyst stage (11. 1% ). There is no significant difference for the cleavage rates in two groups of reconstituted embryos derived from G0-stage and non-G0 stage donor cells respectively. However, G0-stage donor cells could result in higher rate of 8-cell - 16-cell stage embryos significantly (P＜0.05), as well as higher rate of blastocysts (P＜0.01). It seems that using two different culture systems had no significant effects on the cleavage rate, morula rate or blastocyst rate (P＞0.05).     

延边黄牛体细胞核移植胚胎编码抗氧化酶的基因表达研究

为研究延边黄牛体细胞核移植(SCNT)胚胎编码过氧化氢酶(CAT)、锰超氧化物酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的mRNA表达情况,以孤雌激活(PA)胚胎为对照,利用反转录PCR扩增延边黄牛SCNT胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA,琼脂糖凝胶电泳后使用计算机软件进行半定量分析。结果显示:延边黄牛SCNT胚胎编码CAT的基因在2细胞期开始表达,且与PA胚胎存在显著差异(P0.05);编码Mn-SOD的基因在8细胞期开始表达,与PA胚胎在16细胞期以上时期差异显著(P0.05);编码GPx的基因在4细胞期开始表达,与PA胚胎在4细胞期差异显著(P0.05),8细胞期以上时期差异不显著(P0.05)。与孤雌激活胚胎的差异表明SCNT胚胎抗氧化酶表达的异常可能是由核移植操作过程所引起的。