利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米

建立了一种可同时检测9种转基因玉米(Zea mays L.)的可视化膜芯片检测方法。该方法利用紫外交联技术,将9种转基因玉米特异性探针及内源性玉米醇溶蛋白基因(Zein)探针和杂交质控探针固定于尼龙膜表面制成检测芯片。通过多重PCR同时扩增多重靶标片段,生物素化产物与检测芯片杂交。阳性结果由链酶亲和素-碱性磷酸酶及显色底物NBT/BCIP的显色反应在芯片表面形成裸眼可见的点。应用商业化转基因玉米(Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604)、转基因棉花(MON1445、MON15985)、转基因大豆及非转基因材料检验了芯片的性能,结果表明,制备的检测芯片具有良好的特异性和重复性,检测限为0.5%。芯片鉴定结果与PCR产物测序结果一致。     

运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系的研究

[目的]运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系。[方法]基于微滴式数字PCR平台,建立3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法。[结果]特异性试验结果显示,该法只有特定品系的靶序列才有扩增信号。灵敏度试验表明,该方法在10 pg基因组DNA用量时可定量检测到2~16个拷贝。[结论]该研究建立的3种转基因玉米品系定量检测方法特异性强、灵敏度高,可用于进出口农产品中3种转基因玉米品系成分的定量检测。     

转基因油菜RT73品系特异性检测标准分子协同实验验证

对构建的适于转基因油菜RT73品系特异性检测标准分子pEASY-RT73在普通PCR和实时荧光PCR检测中的适用性进行了实验室间协同实验验证。对8家实验室结果的统计分析表明,标准分子pEASY-RT73对转基因油菜RT73品系特异性检测及油菜内源基因HMG和PEP检测具有高特异性。在普通PCR扩增中,标准分子对PEP和RT73品系特异性序列的检测下限均为20拷贝,对HMG基因的检测下限为50拷贝;在实时荧光PCR扩增中,HMG和RT73品系特异性序列的检测下限均为10拷贝,PEP检测下限为50拷贝。虽然各实验室所用仪器和试剂有较大差异,但对检测结果影响不大。因此,标准分子pEASY-RT73可稳定的作为新型标准物质用于转基因油菜RT73品系特异性普通PCR和实时荧光PCR检测。     

口岸重点监控的转基因棉花T304-40品系定量PCR检测方法

以我国口岸重点监控的转基因棉花T304-40品系为研究对象,根据其外源插入片段与基因组DNA3'端邻接区序列设计引物和探针,经筛选和优化后,建立了转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。对方法的适用性测试结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法高度特异于转基因棉花T304-40品系检测,反应效率达94.2%,绝对灵敏度为20拷贝基因组DNA,定量下限为25拷贝基因组DNA。以研制的检测方法建立标准曲线对盲样进行定量分析,结果表明4个盲样的测定值与设定值间的偏差均小于10%。因此,本研究建立的转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可准确地对棉花及其制品中转基因棉花T304-40成分进行定性或定量检测分析。     

转基因玉米TC1507质粒DNA标准物质的研制

标准物质具有特定量值、均匀性和稳定性三大典型特征,也是其作为测量标尺的依据。转基因生物标准物质是我国转基因产品标识制度顺利实施的关键技术支撑之一。文章以转基因玉米TC1507为对象,制备了转化体特异性的新型质粒DNA标准物质pTC1507,并对其均匀性、稳定性、量值进行了评价和测定。测试结果表明,制备的质粒DNA标准物质具有良好的瓶间和瓶内均匀性,pTC1507稳定性可靠,可以在-20 ℃稳定放置6个月以上。经过测序和实时荧光定量PCR定值以及不确定度评估,pTC1507标准物质的量值是1.01±0.053。均匀性、稳定性和量值结果表明,研制的转基因玉米TC1507质粒分子标准物质符合标准物质的典型要求,可以代替传统的基体标准物质应用于转基因玉米检测,解决传统标准物质获取困难、制备复杂、成本高等不足。     

转基因玉米的定性PCR检测

根据玉米内参照基因zSSIIb和转基因玉米中常见的CaMV35S、NOS、Bt、hpt等基因的特异性结构,设计5对定性PCR引物,经定性PCR检测,可以准确地将转基因玉米的目的基因检出,说明这5对引物具有较高的特异性和准确性。由此建立了一套转基因玉米定性PCR检测方法,用于转基因玉米及其产品的筛查、抽检。     

多重DPO-PCR检测转基因玉米MON810和MIR604体系建立

针对转基因玉米MON810和MIR604品系插入位点序列,分别设计品系特异性DPO引物,建立转基因玉米MON810和MIR604品系检测的多重DPO-PCR方法。结果表明,设计的DPO引物特异性强,灵敏度达0.5 ng/μL,并且对退火温度不敏感。该检测方法特异性强、灵敏度高,适合于对转基因玉米MON810和MIR604品系进行快速检测。     

����MPCR����⿹�����ͳ��ݼ�ת��������Bt11

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系.结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT =0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测.     

基于MPCR法检测抗虫与耐除草剂转基因玉米Bt1

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系。结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT=0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测。     

用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。     

蛋白质组学方法评估转基因抗虫玉米非预期效应

【目的】转基因育种是将对人类有益的外源基因通过生物技术整合进受体植物的基因组中,使其获得通过自然进化无法获得优异性状,这是转入外源基因的"预期效应"。然而,外源基因插入受体植物还可能产生无法控制和预期的细胞、代谢或表型等方面的改变,即"非预期效应"。非预期效应是转基因植物安全评价的核心内容之一,也是近年来研究的热点和难点。本研究以抗虫转基因玉米为材料,利用差异蛋白质组学技术比较研究转基因玉米与其非转基因玉米之间的非预期效应,为蛋白质组学技术解析转基因植物非预期效应提供理论参考。【方法】选取4份已经进入中国农业部安全评价阶段转苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringeinsis,Bt)内毒素基因的抗虫玉米材料,即SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd,以及它们的对照玉米材料郑单958和郑58,分别种植于可控人工温室中。待玉米幼苗生长至5叶1心期时,每份材料取长势一致的6个单株最上部完全展开叶片,混合作为一个样本进行取样,并提取叶片蛋白质。双向电泳技术分别分离4种转基因玉米和它们各自对应的非转基因材料高丰度蛋白质组,利用Image Scanner扫描仪扫描脱色后的蛋白质凝胶,PD Quest 8.0软件(Biorad,USA)分析蛋白质凝胶图谱,以蛋白点相对体积(%Vol)来表述每一个匹配蛋白质的表达丰度,将电泳凝胶上特异性蛋白质和相对体积大于2倍的差异蛋白质点取样,依据相应蛋白质数据库进行质谱鉴定,并对鉴定出的特异性和差异性蛋白质进行细胞功能富集分析(GO)和代谢途径富集分析(KEGG),以评价转基因抗虫玉米的可能非预期效应。【结果】通过比较4种不同转基因抗虫玉米及其非转基因对照的高丰度蛋白质组,除目标抗虫基因外,共鉴定出61个蛋白质,其功能主要是富集于光合作用、碳固定、能量转运等基础细胞功能相关酶类,如核酮糖二磷酸羧化酶、ATP合成酶、丙酮酸磷酸双激酶等。仅有少数几个与光合作用、碳固定和ATP合成途径等基础代谢过程相关基因出现上调表达。KEGG分析表明,与对照ZD958相比,SK12-5zd的差异蛋白在光合生物碳固定途径中显著富集;Bt799zd的差异蛋白则分别在光合生物碳固定途径、光合作用和碳代谢途径中显著富集。与对照Z58相比,IE034z和Bt799z的差异蛋白均在光合作用代谢途径中显著富集。证明4种转基因材料与对照蛋白质组相似性较高,未见基因的异常表达。【结论】测试的4种转基因材料在蛋白质水平未发生影响其安全性的非预期效应;当前结果表明蛋白质组学技术可以用来验证转基因植物的非预期效应。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

转基因康乃馨Moonlite品系检测用质粒标准样品研制

截至2020年底,国际上已有19种转基因康乃馨品系进入商业化种植。为了实现转基因康乃馨的有效检测监管,研制检测标准样品十分必要。目前,国际上还没有该类标准品的相关报道。为此,本文研制了商业化时间最长、种植量较大的转基因康乃馨Moonlite品系质粒标准样品,使其与转基因康乃馨检测技术标准的应用相配套,为口岸转基因产品的检测监管提供必要的技术支撑。首先,将康乃馨内源ANS基因1 279 bp片段和转基因康乃馨Moonlite品系406 bp 5'端特异性序列分别插入到pcDNA3.0载体的酶切位点和距离1 kb以上的多克隆位点上,合成质粒DNA标准样品。后将质粒DNA标准样品进行稀释、分装,对其均匀性、最小取样量和短期、长期稳定性等进行测定,采用数字PCR方法对质粒DNA标准样品进行定值,并进行不确定度评估。质粒DNA标准样品pLite经全基因组测序,与公开发布的序列完全一致。均匀性实验结果表明,分别以ANS基因和Moonlite品系特异性序列为目标进行测定,F值分别为1.61和1.14,均小于95%置信区间的F值,质粒DNA标准样品足够均匀。质粒DNA标准样品的最小取样量为2 μL。稳定性实验结果表明,质粒DNA标准样品pLite在45 ℃高温条件下,可稳定保存14 d;在26 ℃及以下温度条件下,可稳定保存1个月,在4 ℃及以下温度可稳定保存6个月,说明质粒DNA标准样品适宜运输。质粒DNA标准样品在反复冻融25次后,拷贝数浓度无显著变化。定值结果表明,质粒DNA标准样品pLite中康乃馨内源ANS基因拷贝数的参考值为(6.13±0.22)×10⁶ μL^-1,Moonlite品系特异性序列拷贝数的参考值为(6.10±0.24)×10⁶ μL^-1。研制的质粒DNA标准样品pLite具有良好的均匀性和稳定性,获得国家标准样品证书后,可用于转基因康乃馨Moonlite品系的检测。     

转基因香石竹Moonlite品系特异性定性PCR检测方法的建立

以转基因香石竹品种Moonlite(月之伊人)为研究对象,通过TAIL-PCR方法,获得外源基因插入位点的左侧旁邻序列。根据旁邻序列设计引物,建立品系特异性定性PCR方法,其扩增片段覆盖了转化载体及香石竹基因组临界序列。本方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确、高效地检测转基因香石竹Moonlite品种。     

转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建

将转基因大豆、玉米和水稻的主要外源Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT 基因和内参RBCL基因目标片段分别克隆到克隆载体pMD18-T中,构建获得的质粒可作为定性检测3种转基因粮食作物的上述外源基因的通用标准分子质粒pMD18-T-PAT-CP4-EPSPS-Cry1A(B)-BAR-RBCL,长约4.7 kb.经过双酶切、测序及PCR扩增,获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段,证明所构建的标准分子质粒是正确的,可以用来作为不同品种转基因粮食作物定性检测CP4-EPSPS基因、Cry1A(B)基因、BAR基因和PAT基因的通用阳性标准分子.     

转cry1Ie基因抗虫玉米对根际微生物群落碳代谢的影响

转基因作物对土壤生态系统的影响日益引起人们的广泛关注。采用Biolog ECO微平板对转基因抗虫玉米IE09S034及其对应的受体玉米根际微生物群落碳代谢功能进行了比较研究。结果表明,转基因抗虫玉米IE09S034对根际微生物碳代谢功能无显著性影响,且发现年份和生育期是引起根际微生物碳代谢情况变化的主要因素。本文为转基因抗虫玉米IE09S034的环境安全性评估提供了新的依据。