牛粪堆肥高温期氨氧化古菌与氨氧化细菌的多样性分析

堆肥化过程中,氨氧化微生物对堆肥原料的氮素转化和氮损失影响重大。为了分析牛粪堆肥高温期微生物的多样性,研究以氨单加氧酶基因（帆胡）为标记,分析了牛粪堆肥高温阶段氨氧化古菌（Ammonia-OxidizingArchaea,AOA）和氨氧化细菌（Ammonia-OxidizingBacteria,AOB）菌群多样性。结果表明,在AOB类群中,亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和亚硝化螺菌属（Nitrosospira）克隆子数量分别占整个克隆文库的59．3％和40．7％,它们是堆肥高温期的优势氨氧化细菌,但是Nitrosomonas的数量比Nitrosospira更占优势。在AOA群落中,soil／sediment菌群占据绝对数量优势,其克隆子数量占AOA文库的94．2％,sea／sediment菌群仅占5．8％。     

大庆龙凤湿地底泥氨氧化细菌与氨氧化古菌多样性分析

为研究湿地底泥中氨氧化细菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria,AOB)与氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea,AOA)的群落多样性,构建AOB与AOA的amo A基因克隆文库,同时利用限制性片段长度多态性(RFLP)技术将克隆文库阳性克隆子进行归类并测序。结果发现,从湿地底泥中均得到3个AOB与AOA的可操作分类单元(OTU)。其中,所有的AOB均属于亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas),而AOA属于泉古菌门(Crenarcharota),与河口沉积物等环境中获得的序列具有较高同源性。     

双价转基因抗虫棉花对土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌群落结构及丰度的影响

采用末端片段多态性分析(T-RFLP)和实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)方法,研究了不同生长时期双价转基因抗虫棉花和亲本非转基因棉花(对照)土壤氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)群落结构和丰度的变化,以探讨双价转基因抗虫棉花种植对土壤氨氧化微生物的影响。结果表明,双价转基因抗虫棉花土壤中AOB和AOA优势种群与对照相同,且随生长时期无显著变化,但在各自样品中所占比例不同。不同生长时期双价转基因抗虫棉花土壤AOB的Shannon指数和Evenness指数均与对照无显著差异,AOA的Shannon指数与对照也无显著差异,而苗期时Evenness指数显著低于对照(P0.05),其他3个生长时期差异均不显著。qPCR分析表明,除花铃期双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度高于对照外,其他3个生长时期均低于对照,而AOA丰度在4个生长时期均低于对照。吐絮期时,双价转基因抗虫棉花与对照土壤AOB和AOA丰度均差异显著(P0.05)。双价转基因抗虫棉花对土壤AOB和AOA群落结构组成无显著影响,但降低了AOB和AOA的数量,双价转基因抗虫棉花对土壤微生物的某些类群可能存在潜在影响。     

长期施氮对酸性紫色土氨氧化微生物群落及其硝化作用的影响

目的研究长期施氮对酸性紫色土壤中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）群落特征的影响,揭示氨氧化微生物群落的驱动因子及其调控硝化作用的微生物学机制。方法依托四川雅安玉米体系施氮长期定位试验（始于2010年）,试验处理包括5个供氮水平,即0（N0）、90（N90）、180（N180）、270（N270）和360（N360）kg N·hm^-2,通过Illumina Miseq高通量测序技术测定AOA和AOB的群落,探究长期施氮对氨氧化微生物群落介导的硝化作用的影响。结果 长期施氮影响AOA和AOB的α-多样性（包括丰富度指数和香农-威纳指数）、群落结构和群落组成。其中,随着施氮量的增加,AOA 丰富度指数无显著变化,香农-威纳指数显著降低,AOB 丰富度指数和香农-威纳指数均显著增加;长期不同供氮水平显著影响AOA和AOB的群落结构,供氮水平的增加显著降低AOB优势类群中 Nitrosospira Cluster 3a.1的相对丰度（P<0.05）,同时显著增加了Cluster 3a.2、Cluster 9和Cluster 1的相对丰度（P<0.05）,而对AOA优势类群无显著影响。土壤pH、全氮（TN）、有机质（SOM）、NH₄⁺-N和NO₃^--N均显著影响AOA和AOB的α-多样性,其中,pH与AOB 丰富度指数和香农-威纳指数呈显著负相关（P<0.01）,而与AOA 香农-威纳指数呈显著正相关,而TN、SOM、NH₄⁺-N和NO₃^--N与AOB 丰富度指数和香农-威纳指数呈显著正相关,与AOA 香农-威纳指数呈显著负相关。同时,pH、TN、NO₃^--N 、SOM 和NH₄⁺-N显著影响AOA和AOB的群落结构（P<0.05）。结构方程模型（SEM）的结果表明,长期施氮通过降低土壤pH、提高TN和NO₃^--N含量、改变AOA和AOB的α-多样性和群落结构,进而提高了土壤的硝化势。结论 长期施氮通过改变酸性紫色土壤pH、TN、NH₄⁺-N和NO₃^--N和氨氧化微生物的α-多样性和群落结构进而影响了硝化势。     

东北沼泽湿地土壤中氨氧化微生物活性和丰度研究

为了研究东北典型沼泽湿地——三江湿地和扎龙湿地表层土壤中氨氧化微生物的活性和丰度,采用氯酸盐抑制亚硝酸盐氧化菌(Nitrite-oxidizing bacteria,NOB)和氨苄青霉素抑制氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)以及荧光定量PCR的方法,分析了生长季和非生长季氨氧化微生物的活性和丰度的关系。结果表明:在不同类型的湿地土壤中,pH值显著地影响湿地土壤中氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)的潜在氨氧化活性(Potential ammonia oxidation activity,PAO)(P0.01)。AOA的丰度值与PAO_(AOA+AOB)呈显著正相关(r=0.96,P0.05),而与PAO_(AOA)不存在相关性(P0.05)。三江湿地的毛苔草和小叶章土壤中的PAO_(AOA+AOB)、PAO_(AOA)、AOA丰度与AOB丰度,并无显著差异。研究表明植被的差异并没有影响土壤中氨氧化微生物的潜在氨氧化活性以及氨氧化微生物的丰度,但在抑制AOB活性之后毛苔草土壤中的PAO出现了显著的下降(P0.05),表明AOB在毛苔草土壤中的氨氧化过程中发挥着重要作用。     

玉米-大豆间作对玉米根际氨氧化微生物的影响

以氨单加氧酶基因(amo A)为分子标记,采用real time PCR和克隆文库的方法,研究玉米-大豆间作对玉米根际氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的丰度、群落多样性及系统发育的影响。结果表明,间作玉米根际总细菌和AOA的数量均显著高于单作玉米根际。概念种或操作分类单元(OTUs)分析结果表明,间作玉米根际AOA和AOB的多样性均高于单作玉米根际。间作玉米根际AOA共获得23个OTU,AOB共获得16个OTU,单作玉米根际AOA和AOB分别获得13个OTU和20个OTU。系统发育分析结果表明,间作抑制了玉米根际AOB的Nitrosomonadaceae类群生长,促进了Nitrosospira cluster 3a类群和1个新类群的生长。AOA则在间作的玉米根际下分散到不同分支中,并在一定程度上促进了cluster water类群和cluster 1类群的生长,抑制了cluster 6类群的生长。     

滇池沉积物中好氧氨氧化细菌群落多样性研究

从滇池沉积物中提取好氧氨氧化细菌(aerobic ammonium-oxidizing bacteria,AOB)的DNA,通过构建硝化作用氨单加氧酶基因(amo A)文库并划分操作分类单元(OTU)的方法,揭示好氧氨氧化细菌群落结构多样性。获得了80个amo A基因克隆,利用Mothur软件将相似度不小于97%的序列归为1个OTU,共得到22个OTUs,其中OTU1、OTU2、OTU3单元最大,分别包含了27、12、9条序列。对22个OTUs的代表序列进行系统发育分析表明,其序列都属于变形杆菌的β-亚纲,分布于亚硝化螺菌属、亚硝化弧菌属、亚硝化单胞菌属、亚硝化叶菌属4个属;优势种群为Nitrosomonas europaea的近缘种,尚未被描述过。     

生物炭与有机肥对菜田土壤氨氧化菌丰度的影响

通过土壤培育试验,运用定量PCR技术,研究了添加生物炭和有机肥对土壤氮营养及氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)丰度的影响。结果表明,土壤培育时间、有机肥显著增加硝态氮的含量(P0.001),促进硝化作用;生物炭通过抑制有机氮矿化作用降低硝化作用,106d时生物炭处理的硝态氮、可溶性总氮含量低于没有生物炭的处理(P0.05),并且中和了有机肥对矿化作用的促进效应。随着处理时间的延长,生物炭促进氨氧化菌群的丰度,AOA丰度的提高较AOB显著,且AOA丰度的变化与硝态氮含量的变化呈正相关。因此认为AOA是土壤中氨氧化作用的主要驱动力,且生物炭与有机肥主要对AOA的丰度产生影响。     

模拟水位下降与刈割对高寒湿地土壤氨氧化与反硝化微生物的影响

湿地土壤是温室气体重要的源和汇,认识湿地生态系统氮循环过程有助于预测氮循环对未来气候变化的响应与反馈机制。为探讨硝化作用和反硝化作用对土壤水位变化和刈割的响应机制,依托于2013年在青藏高原东部若尔盖泥炭地南部湿地设置的野外实验,通过在样地周围挖掘不同深度的排水沟模拟水位下降,结合刈割处理,研究水位下降和刈割对泥炭地土壤氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)、氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和反硝化细菌(Denitrifying bacteria)丰度的影响。2014年7月取样分析结果表明:水位下降显著降低土壤含水量,水位下降与刈割均显著降低土壤呼吸;氨氧化及反硝化微生物功能基因丰度在各处理间无显著差异,但刈割及其与水位下降的交互作用显著影响AOA-amo A与AOB-amo A基因丰度比。刈割处理显著增加AOB-amo A基因相对丰度,但对AOA-amo A基因丰度无显著影响,揭示AOB可能在湿地土壤硝化过程中占主导地位。土壤nir S基因丰度显著高于nir K基因,表明nir S基因对水位下降及刈割的响应更为敏感。随着土壤水位的下降,刈割促进了由AOB主导的氨氧化过程,而反硝化微生物丰度的增加削减了氨氧化产物硝酸盐的积累,继而降低了土壤硝酸盐含量。     

O3浓度升高对麦田土壤氨氧化细菌、氨氧化古菌和硝化细菌数量的影响

硝化作用在氮循环过程中至关重要,包括氨氧化作用和亚硝酸盐氧化作用,通过氨氧化反应和亚硝酸盐氧化反应将N素转化为植物可利用的NO3-形态。利用开顶式臭氧气室(OTCs,open-top chambers)试验平台,通过大田模拟熏气试验,结合Real-timePCR探讨大气O3浓度升高对麦田土壤氨氧化细菌(AOB)、氨氧化古菌(AOA)及硝化细菌(NOB)数量的影响。结果表明,AOB、AOA和NOB对O3胁迫的反应不一样,AOB基因拷贝数基本上随着O3浓度的升高呈现出降低的趋势,而AOA和NOB基因拷贝数随O3浓度的升高变化不明显。冬小麦拔节期,当O3浓度为40、80、120nmol·mol-1时,20～40cm土层的AOB基因拷贝数分别比对照处理降低39.8%、51.2%和59.4%。AOB和NOB基因拷贝数灌浆期多于收获期,0～10cm土层多于10～20cm。AOA基因拷贝数随季节的变化不大。O3胁迫可通过影响AOB、AOA和NOB的数量和活性来影响土壤的硝化反应,从而影响土壤的氮素循环过程。     

长期咸水滴灌对土壤氨氧化微生物丰度和群落结构的影响

为探讨长期咸水滴灌对棉田土壤氨氧化细菌（AOA）和氨氧化古菌（AOB）的丰度和群落结构的影响,于2018年采集已经过10年咸水滴灌的棉田土壤,通过实时荧光定量PCR和高通量测序技术测定土壤AOA和AOB的丰度和群落结构。试验设3个灌溉水盐度水平：0.35、4.61 dS·m^-1和8.04 dS·m^-1（分别代表淡水、微咸水和咸水）。结果表明：微咸水、咸水灌溉显著降低土壤NO₃^--N含量和潜在硝化势（PNR）,但显著增加土壤盐分和NH₄⁺-N含量。不同处理AOA和AOB的amoA基因拷贝数分别为2.2×10⁶~3.6×10⁶copies·g^-1和1.9×10⁵~3.2×10⁵ copies·g^-1干土;微咸水、咸水处理AOA和AOB amoA基因拷贝数均显著低于淡水处理,且微咸水处理显著降低AOA/AOB。PNR与AOA丰度（P<0.001）和AOB丰度（P<0.001）均呈显著正相关关系。此外,不同灌溉水盐度下AOA群落操作分类单元（OTUs）的数量大于AOB,微咸水、咸水灌溉显著降低AOB群落的OTUs。与淡水处理相比,咸水、微咸水处理显著增加AOA群落的香农指数,咸水处理显著降低AOB群落的香农指数。AOA和AOB群落的优势类群分别为Candidatus Nitrosocaldus和Nitrosospira;咸水、微咸水处理抑制AOA群落的Betaproteobacteria生长,而咸水处理中Candidatus Nitrosocaldus显著高于淡水和微咸水处理。AOB群落中Nitrosomonas的相对丰度随着灌溉水盐度的增加而显著降低。LEf Se分析显示,AOA在咸水灌溉下仅有1个差异物种,而AOB在微咸水灌溉时有5个差异物种。冗余分析结果显示：AOA群落结构的改变与土壤NO₃^--N、pH和盐度的变化密切相关,而AOB群落结构的改变仅与NO₃^--N和pH显著相关。盐分是影响氨氧化微生物生长及群落结构的主导因素,AOA和AOB共同参与土壤硝化作用,淡水、微咸水灌溉条件下AOB可能是硝化作用主导微生物种群,而咸水灌溉条件下AOA可能是主导微生物种群。     

Abundance and Community Composition of Ammonia-Oxidizers in Paddy Soil at Different Nitrogen Fertilizer Rates

Ammonia oxidation, the first and rate-limiting step of nitrification, is carried out by both ammonia-oxidizing bacteria （AOB） and ammonia-oxidizing archaea （AOA）. However, the relative importance of AOB and AOA to nitrification in terrestrial ecosystems is not well understood. The aim of this study was to investigate the effect of the nitrogen input amount on abundance and community composition of AOB and AOA in red paddy soil. Soil samples of 10-20 cm （root layer soil） and 0-5 cm （surface soil） depths were taken from a red paddy. Rice in the paddy was fertilized with different rates of N as urea of N1 （75 kg N ha＂ yr-1）, N2 （150 kg N ha~ yrl）, N3 （225 kg N ha1 yrl） and CK （without fertilizers） in 2009, 2010 and 2011. Abundance and community composition of ammonia oxidizers was analyzed by real-time PCR and denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE） based on amoA （the unit A of ammonia monooxygenase） gene. Archaeal amoA copies in N3 and N2 were significantly （P〈0.05） higher than those in CK and N1 in root layer soil or in surface soil under tillering and heading stages of rice, while the enhancement in bacterial amoA gene copies with increasing of N fertilizer rates only took on in root layer soil. N availability and soil NO3--N content increased but soil NH4＋-N content didn＇t change with increasing of N fertilizer rates. Otherwise, the copy numbers of archaeal amoA gene were higher （P〈0.05） than those of bacterial amoA gene in root lary soil or in surface soil. Redundancy discriminate analysis based on DGGE bands showed that there were no obvious differs in composition of AOA or AOB communities in the field among different N fertilizer rates. Results of this study suggested that the abundance of ammonia-oxidizers had active response to N fertilizer rates and the response of AOA was more obvious than that of AOB. Similarity in the community composition of AOA or AOB among different N fertilizer rates indicate that the community composition of ammonia-oxidizers was relatively stable in the paddy soil at least in short term for three years.     

牛场肥水灌溉对土壤氨氧化微生物的影响

以不同牛场肥水灌溉制度下河北省徐水县梁家营长期定位施肥试验田为研究对象,通过构建氨氧化细菌和氨氧化古菌的amoA 基因克隆文库,利用T-RFLP方法研究了5种施肥处理(CK:不施肥;CF:300 kg N·hm^-2,120 kg P₂O·hm^-2,75 kg K₂O·hm^-2;T4:105 kg N·hm^-2,39 kg P₂O₅·hm^-2;T5:210 kg N·hm^-2,78 kg P₂O₅·hm^-2; T11:317 kg N·hm^-2,117 kg P₂O₅·hm^-2)下土壤中氨氧化细菌及氨氧化古菌的多样性及其群落结构演变。氨氧化细菌T-RFLP结果显示,T5 处理土壤中氨氧化细菌的 Shannon-Wiener指数(H')和 Pielou指数(E)均最高, T11处理最低,表明T5处理增加了土壤中氨氧化细菌的多样性和丰富度,T11处理一定程度上降低了氨氧化细菌的多样性和丰富度。基于amoA基因建立的系统进化树显示,土壤中氨氧化细菌主要属于Nitrosospira 和Nitrosomanas。氨氧化古菌T-RFLP结果显示,T11处理氨氧化古菌Shannon-Wiener指数(H')、Simpson 指数(Ds)和Pielou指数(E)均最高,表明T11处理增加了土壤中氨氧化古菌的多样性和丰富度。氨氧化古菌的系统发育树显示大部分氨氧化古菌amoA序列与 Cluster S 聚为一类,且占主导地位,少数序列为Unclassified-Archaea(未分类古菌)。最大优势菌与来自中国荷斯坦奶牛瘤胃样品的氨氧化古菌Clone属于同种,推测牛场肥水灌溉增加了土壤的氨氧化古菌的群落多样性。     

氮高效转基因水稻OsNRT2.3b对土壤氨氧化细菌群落多样性的影响

以氮高效转基因水稻Os NRT 2.3b两个不同株系N-04和N-08为研究对象,以非转基因亲本日本晴(Nipp)为对照,在田间小区试验条件下,设施氮和不施氮两种处理,采用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,分析了氮高效转基因水稻在生长期对土壤氨氧化细菌群落多样性的影响。研究发现,水稻土壤氨氧化细菌丰富度指数在各生长期内品种间均不存在显著差异。两种处理条件下N-04的土壤氨氧化细菌香农-威纳指数仅在拔节期与Nipp有显著差异,其余生育期均无显著差异;在施氮条件下N-08的土壤氨氧化细菌香农-威纳指数在拔节期和抽穗扬花期与Nipp存在显著差异,不施氮条件下仅拔节期出现显著差异。两种处理条件下,N-04的土壤氨氧化细菌均匀度指数与Nipp相比整个生长期均无显著差异,而N-08在拔节期显著低于Nipp。测序结果表明,施氮和不施氮处理下氮高效转基因水稻(N-08和N-04)与Nipp相比土壤中拥有更多的亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)。研究表明,氮高效转基因水稻在个别生育期对香农-威纳指数和均匀度指数有显著差异,且其更有利于促进土壤铵态氮向硝态氮的转化。     

长期施肥对旱地土壤中氨氧化微生物丰度和分布的影响

采用基于氨单加氧酶基因(amoA)的荧光定量PCR技术,以黄土高原旱地土为材料,研究长期施肥对土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度的影响,并分析环境因素与氨氧化菌丰度的关系。以不施肥土壤为对照(CK),设置3个施肥处理,分别为单施磷肥(P),氮、磷共施(NP)和氮、磷、有机肥共施(NPM)3个处理。结果表明,不同处理氨氧化菌amoA基因拷贝数为1.326×106～1.886×106 g-1,各处理间氨氧化细菌丰度差异不显著;氨氧化古菌的arch-amoA基因拷贝数为1.329×106～4.510×106 g-1,表现为处理NPM>NP>CK>P,NPM处理为对照的3.314倍,二者呈现显著性差异。采用DCCA法对4个处理进行环境相似度分类,结果显示,P和NPM处理、CK和NP处理分别构成了2个相似类群;4个处理和12个环境因子的关联(CCA)分析表明,不同处理中的氨氧化微生物活跃度以及氨氧化过程强度表现为处理NMP>NP>CK>P;不同环境因子和不同施肥处理生境相似度分布存在不同的关系,其中反映氨氧化过程的硝态氮含量、氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度,以及代表微生物生长主要环境因素的pH值、含水量、全氮和有机碳含量与不同施肥处理导致的生境相似度的分布关系最为紧密。     

好氧堆肥中amoA硝化细菌群落动态变化

为减少堆肥氮素损失,优化堆肥工艺,以牛粪和玉米秸秆为材料进行高温好氧堆肥,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和产物序列分析法,研究了堆肥不同阶段amoA硝化细菌群落结构组成和多样性的动态变化及与堆肥理化因子的相关性。结果表明:经高温期amoA硝化细菌类群发生明显演替,降温期检测到前期不存在的硝化类群,属于β-变形菌纲(β-Proteobacteria)中的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)。堆肥过程始终存在的优势菌群属于β-变形菌(β-Proteobacteria)中的亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和不可培养细菌(Uncultured bacteria)。堆肥不同时期amoA硝化细菌多样性指数发生变化,升温至高温期减小,降温期增大,腐熟期减小。冗余分析(RDA)结果表明,铵态氮含量和温度与amoA硝化细菌群落结构组成显著相关(P0.05),是影响其动态变化的关键理化因子。