牛SRY序列的体外扩增

建立了用PCR(polymerase chain reaction)技术扩增牛SRY序列的方法.在牛、猪、山羊和绵羊的SRY同源序列高度保守区设计一对引物,两条引物均为22NT,对公牛SRY序列的163 bp进行体外扩增.提取牛基因组DNA,用作PCR扩增的模板,采用3×2×3因子组合,建立了PCR扩增牛SRY序列的最适条件.应用设计的引物和最适条件扩增了20头牛的DNA样品.结果表明,公牛样品均出现预期的SRY特异性扩增带,大小为163 bp,而母牛样品不能扩增出特异带.因此所扩增的序列为公牛特异的SRY序列,且片段大小与设计的序列完全一致.     

真姬菇栽培菌株的ITS和SSR分析

采用ITS和SSR分子标记技术,对27个真姬菇菌株进行遗传分析.通过内转录间隔区(ITS)区域测定和比较分析,结果显示:供试菌株ITS序列长度为594 bp,与GenBank上登录的真姬菇菌株ITS序列相似度为99%以上,在种的水平上证明供试菌株为真姬菇.利用简单重复序列(SSR)标记技术和转移扩增技术,根据香菇、糙皮侧耳、灰盖鬼伞基因组序列设计引物,对真姬菇供试菌株基因组DNA进行扩增.从54对引物中筛选出23对能够扩增出稳定带型且菌株之间带型差异明显的SSR引物.利用23对引物对全部供试菌株进行扩增,共扩增133条条带,其中多态性条带为108条,多态性比率达到81.2%.UPGMA聚类分析结果表明:大部分常规栽培菌株和工厂化栽培菌株聚在不同组,说明两者之间的遗传背景存在明显差异.根据获得菌株的特有SSR标记分析表明:利用7对引物可以将工厂化栽培菌株区分开,其中2个工厂化栽培菌株各自具有1条特异条带,其他工厂化栽培菌株均可通过引物组合法区分开.     

连续多重PCR牛胚胎性别鉴定

本实验以BOV97M序列和牛的1．715卫星DNA序列设计引物进行PCR扩增，其中前者为雄性特异扩增，后者为雌雄共同扩增，以进行牛的性别鉴定。PCR扩增共进行43个循环，其中前11个循环为雄性特异扩增，在随后的33个循环中，再加入内标引物，即进行多重PCR扩增，其灵敏度可达到10pg级(约3个细胞)。     

利用SCAR-PCR检测杂交油菜"蜀杂9号"的杂种纯度

用两个分别能在“蜀杂9号”父、母本之间稳定产生多态性的随机引物S18和S31,对父、母本DNA样品进行RAPD扩增,将得到的特异标记片段S18750和S31550进行回收、克隆和测序。根据测序结果设计序列特异性扩增(SCAR)引物SZ9SP1和SZ9SP2,将“蜀杂9号”的亲本RAPD标记转化为序列特异的SCAR标记。当用两对引物分别扩增杂种F1代单株总DNA时,能分别获得父、母本特异序列扩增带,表明获得的SCAR标记能可靠地用于“蜀杂9号”杂种纯度的检测。     

山核桃SSR标记的初步开发

基于山核桃Carya cathayensis脂肪代谢相关cDNA文库的部分测序结果,发现43条cDNA序列具有简单重复序列(SSR)碱基重复特点,用Primer Premier 5设计了34对表达序列标签-简单重复序列(EST-SSR)引物;建立了适用于山核桃的SSR分析体系,并用设计的SSR引物对对天然群体山核桃40个样品进行了初步的应用性试验.结果表明:34对引物中有4对无扩增产物,3对引物的扩增产物超过了设计范围,27对引物在供试的40个山核桃材料中有较清晰且稳定的目标扩增产物,其中有18对引物的扩增产生了22个多态性位点,占总扩增位点数的47.8％.将SSR标记分析结果与山核桃已有的显性标记分析结果进行比较,发现SSR标记多态性位点的比例较高,且能够区分显性纯合位点及显性杂合位点.结论:设计开发山核桃的EST-SSR标记是可行有效的.     

葡萄EST-SSR标记的开发及其应用

从NCBI公共数据库中随机下载葡萄表达序列标签(expressed sequence tag,EST)8 925条,利用Phrap软件对这些序列进行拼接后形成5 642条序列,利用MISA软件共发掘出含有SSR位点的序列336条,共含有367个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为6.50%。二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复单元的SSR数目分别为79(21.53%)、83(22.62%)、29(7.9%)、60(16.35%)和116(31.61%)。利用Primer 3.0 Plus软件随机设计50对引物进行PCR扩增,用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些SSR引物的PCR扩增产物多态性。50对引物中有36对引物能在20个葡萄品种中扩增出理想的PCR产物,占总引物的72%。其中,26对引物扩增条带具有多态性。利用16对经过验证的EST-SSR引物对20个葡萄品种亲缘关系的分析获得了理想的研究结果。     

磁珠富集法开发长臀鮠微卫星分子标记

为长臀鮠遗传育种、种质鉴定和种苗流放等提供理论依据,采用磁珠富集法开发长臀鮠(Cranoglanis bouderius)微卫星分子标记,筛选获得阳性克隆进行分析,选取侧翼较长的序列,用Primer Premier 5.0设计合成引物。结果表明:从596个白斑中筛选获得80个阳性克隆,测序获得微卫星序列47个,其中完美型31个(66%),非完美型14个(30%),复合型2个(4%)。设计合成32对引物,通过优化反应条件,得到27对引物能扩增特异条带,其中多态性引物24对。     

稻蝗属特异性SCAR分子标记的鉴定

【目的】研究稻蝗属特异性DNA分子标记,为稻蝗属物种的分类鉴定提供快速有效的分子检测方法。【方法】基于稻蝗属物种及其近缘属种的大量RAPD-PCR结果,筛选出稻蝗属物种特异性的RAPD条带,对该特异RAPD条带进行克隆、测序。基于所测序列设计特异引物,以稻蝗属不同物种和蝗总科其它物种基因组DNA为模板进行PCR扩增。【结果】随机引物S823可在稻蝗属不同物种扩增出约650bp的RAPD条带,经对该条带的克隆、测序,发现在3个受试的稻蝗属物种中序列同源度达92.3%—96.6%,序列G+C含量大于15%,并富含大量的A、T重复区;基于已知序列设计的特异引物对稻蝗属7个物种可以扩增出目的条带(550bp),而对赤胫伪稻蝗及蝗总科其它物种均无扩增条带。【结论】鉴定了稻蝗属特异的RAPD条带,基于该条带序列设计的特异引物可用于稻蝗属物种的快速分子鉴定。     

用SAM法分离谷子SSR位点的研究

首次将SAM(选择扩增微卫星)法用于谷子SSR位点的分离,共获得163个含有SSR序列的克隆,其中unique SSR 106个,占所有SSR序列的65%,60个SSR序列的3′端成功设计特异引物,占unique SSR的56%。这60个SSR序列中,55个为完整型重复;5个为复合型重复,由2种不同的重复单元组成,没有发现不完整重复类型。同时讨论了SAM法在应用过程中应注意的一些关键技术环节,如接头连接、核苷酸选择策略、特异引物设计原则,及该方法存在的一些不足,如获得SSR重复次数少、一端侧翼序列缺失对扩增多态性的消极影响等。     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348 bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.