中红侧沟茧蜂非典型气味受体的克隆及组织特异性表达

 【目的】研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator非典型气味受体的表达谱。【方法】使用RT-PCR法克隆得到中红侧沟茧蜂非典型气味受体基因序列。使用实时荧光定量PCR法研究其表达谱。【结果】克隆得到中红侧沟茧蜂非典型气味受体全长基因。该基因在触角中特异性表达。在雌虫触角中羽化当天达到最大表达量,雄虫触角中在羽化前d阶段达到最大表达量。【结论】该非典型气味受体在中红侧沟茧蜂触角中特异存在。     

捕食性天敌叉角厉蝽生长发育、繁殖及各虫态形态特征观察

【目的】明确叉角厉蝽[Eocanthecona furcellata(Wolff)]从卵到成虫发育历期及繁殖能力,比较叉角厉蝽各虫态的主要形态鉴别特征,为叉角厉蝽的扩繁及生防潜能开发提供理论支持。【方法】在室内条件下,以云南元江采集并在室内扩繁6代以上的叉角厉蝽为研究对象,在培养皿中采用单头饲养的方法测定叉角厉蝽生长发育指标(卵孵化率、若虫存活率、卵到成虫的发育历期),在饲养盒中雌雄虫配对共培养测定其成虫繁殖力特征。运用显微照相系统比较叉角厉蝽各虫态的主要形态特征。【结果】叉角厉蝽从卵到成虫的平均发育历期为29.00±1.41 d,卵历期为8.00±0.21 d,若虫期为19.76±0.12 d,1~5龄若虫平均发育历期为3.24~5.38 d,卵孵化率为92.91%,若虫存活率为80.21%,雌、雄成虫的平均寿命分别为35.40±1.96和37.40±2.65 d;叉角厉蝽雌成虫交配后,一生平均产卵次数为4.73±2.01次,最多9次,最少2次,平均产卵前期为7.87±2.75 d,产卵期持续14.33±5.13 d,雌成虫与雄成虫交配单次平均产卵量为59.46±15.77粒,未交配雌成虫单次平均产卵量为29.34±15.31粒且为无效卵,最终无法孵化。叉角厉蝽卵为矮杯形或圆筒形,具卵盖,边缘有10~12根刺状精孔突,有金属光泽;1~5龄若虫体色红黑相间,若虫触角4节。1龄若虫触角第2和第3节末端有明显白色环,喙暗红色,接近体长,无翅芽;2龄若虫头部前段扁平突出,触角节间环变为红色,喙黑色;3龄若虫触角第2和第3节末端红色环明显,喙长为体长的一半;4龄若虫喙长为体长的一半,胸部刻点明显,出现翅芽,并延伸至胸部末端;5龄若虫喙暗红色,短于体长一半,中足和后足胫节中部出现白斑,翅芽延伸至腹部第3节;成虫体色黄褐与黑褐混杂相间,密布刻点,触角5节,喙黄褐色,最后一节黑色,喙长短于体长的一半,前胸背板侧角呈剑叉状突出,雄虫腹部近三角形,雌虫腹部卵圆形。【结论】明确了叉角厉蝽的发育历期和繁殖能力,证实叉角厉蝽无孤雌生殖现象。农业生产中可以喙的颜色、长度及翅芽发育作为叉角厉蝽主要形态鉴别特征。     

亮腹釉小蜂不同发育阶段的形态及寄生行为

【目的】研究柑橘木虱Diaphorina citri优势寄生蜂亮腹釉小蜂Tamarixia radiata的个体发育形态学及寄生行为,为柑橘黄龙病的生物防控提供理论和技术指导。【方法】在温度为(26±1)℃、相对湿度为60%~80%的试验条件下,观察亮腹釉小蜂寄生行为及个体发育形态,并测量形态学指标。【结果】亮腹釉小蜂寄生柑橘木虱3~5龄若虫产卵;亮腹釉小蜂整个发育历程分为卵、幼虫、蛹、成虫4个阶段;室内条件下其世代发育历期约为13.40 d;雌虫个体明显大于雄虫;雄虫触角刚毛发达,几乎覆盖整个触角基节,而雌虫触角刚毛很短,触角基节清晰可见;雌虫腹部背面黄色区域明显大于雄虫。【结论】亮腹釉小蜂为柑橘木虱体外寄生蜂,雌、雄成虫形态有显著差异。     

甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体制备及其在不同发育时期蛋白表达

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde Ⅰ和Xba Ⅰ限制性内切酶连接到原核表达载体pCzn1。将重组表达载体pCzn1-Vg转入大肠杆菌Arctic Express,离心收集诱导表达的菌液,超声波破碎菌体沉淀,取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测,分析Vg重组蛋白的可溶性。在不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白,筛选最优表达条件。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了Vg重组蛋白,将该蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗Vg血清抗体。采用间接ELISA方法检测血清抗体的效价,并通过Western blot法检测甜菜夜蛾雌虫不同发育阶段血淋巴中Vg蛋白的表达差异。【结果】扩增所得Vg基因片段为2 091 bp,编码697个氨基酸,预测蛋白分子量为80.88 k D。通过大肠杆菌表达出的Vg重组蛋白相对分子量为80 k D,其大小与预期的Vg重组蛋白带大小相符合。其主要以包涵体形式表达,而在上清中表达量不明显。不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白的结果显示温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1)时,Vg重组蛋白表达量最高。继续提高温度和IPTG浓度,对提高Vg重组蛋白的表达量无明显作用,且杂蛋白增多。新西兰白兔经4次免疫后,间接ELISA法检测表明,制备的兔抗Vg抗体具有较好的灵敏度,效价达到1﹕512 000。Western blot检测Vg蛋白在甜菜夜蛾不同发育阶段血淋巴中的表达,其杂交出的单一条带在180 k D左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期开始微弱表达。雌成虫羽化后血淋巴中Vg蛋白表达量先升高后降低,呈动态变化,到羽化48 h表达量最高,随后降低。【结论】纯化获得了Vg重组蛋白,并明确了最优表达条件(温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1));制备了高效价的甜菜夜蛾Vg多克隆抗体,明确了甜菜夜蛾Vg蛋白的表达规律。     

光肩星天牛mRNA差异显示体系的建立与触角差异表达基因的筛选

【目的】建立一套适合光肩星天牛的mRNA差异显示(DDRT-PCR)体系,并对光肩星天牛触角差异表达基因进行初步研究。【方法】以光肩星天牛雌、雄个体的触角和去触角的身体部分为材料,对影响mRNA差异显示体系的主要因子进行优化,并研究了其差异表达基因。【结果】建立了适合光肩星天牛mRNA差异显示的反应体系,并筛选得到最适的PCR退火温度。使用此体系分离得到28条触角差异表达基因片段,其中9个片段的翻译产物分别与觅食相关蛋白、MYB转录因子、β-乙酰葡萄糖胺转移酶、化学感受蛋白11、表皮蛋白peritrophins1-I、甘油激酶、抗菌肽Alo-3、26S蛋白酶体(非ATP酶亚基12)和清道夫受体等已知蛋白有较高的同源性。【结论】利用建立的DDRT-PCR体系对供试材料进行扩增,扩增产物条带丰富且清晰,可用于分离差异表达基因,得到的触角差异显示基因可能参与了光肩星天牛的嗅觉识别过程。     

牧草盲蝽对5种寄主植物的行为反应及其种群动态

【目的】研究牧草盲蝽成虫对5种寄主植物选择行为反应,分析其在寄主植物上的种群发生动态,为筛选棉田牧草盲蝽诱集植物提供理论基础。【方法】采用Y-型嗅觉仪,测定牧草盲蝽成虫(雌虫和雄虫)对红花、龙葵、木地肤、反枝苋和棉花的选择行为反应,并利用目测法对5种寄主植物上的牧草盲蝽种群数量进行调查。【结果】牧草盲蝽雌、雄成虫偏好选择木地肤、红花和棉花。5种寄主植物牧草盲蝽(成虫和若虫)种群平均密度差异显著。其中,木地肤中牧草盲蝽(成虫和若虫)种群平均数量最多,显著高于红花、龙葵、反枝苋和棉花;其次为红花。调查时间、寄主植物种类以及调查时间与寄主植物种类的密度交互作用均显著影响牧草盲蝽(成虫和若虫)种群密度。【结论】红花可作为棉田牧草盲蝽潜在的诱集植物。     

白蜡虫泌蜡初期全长转录组测序及FAR在雌雄虫中蛋白表达分析

【目的】了解白蜡虫[Ericerus pela (Chavannes)]二龄雄虫泌蜡初期的基因表达,鉴定参与白蜡合成的脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-CoA reductase,far)基因,并明确FAR在白蜡虫雌雄虫中的蛋白表达情况。【方法】采用三代全长转录组测序,分析白蜡虫二龄雄虫泌蜡初期表达的基因,筛选获得与白蜡虫泌蜡相关的far基因;对关注的1个FAR制备单克隆抗体,通过Western-blot分析该FAR在白蜡虫雌雄虫中的表达情况。【结果】对白蜡虫泌蜡初期的二龄雄虫成功进行了转录组测序,共获得81个far基因,筛选获得与白蜡虫泌蜡一致的6个基因,本研究关注的far基因命名为far3;成功制备了FAR3的单克隆抗体,通过单克隆抗体分析了FAR3在白蜡虫雌雄虫中的表达情况,证实FAR3在二龄雄虫中大量表达,在雌虫中有微量表达。【结论】本研究通过对泌蜡初期的白蜡虫二龄雄虫进行三代全长转录组测序获得了与白蜡虫泌蜡相关的far基因;通过制备的FAR3单克隆抗体证实了FAR3在二龄雄虫分泌白蜡期高量表达,这为白蜡虫其他far基因功能研究以及探索白蜡虫泌蜡分子机理奠定了基础。     

寄主对斜纹夜蛾实验种群生殖力的影响

【目的】斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius是一种多食性害虫,繁殖能力强,全球范围内均有分布。但是寄主对斜纹夜蛾繁殖力影响机制还不清楚。开展寄主对斜纹夜蛾实验种群生殖力的影响研究,为斜纹夜蛾的预测预报以及防治提供理论依据。【方法】通过单头饲养的方法,研究斜纹夜蛾取食甘蓝、空心莲子草和地瓜后的产卵量、卵黄原蛋白(Vg)及卵黄原蛋白受体(VgR)表达的变化。【结果】幼虫取食不同寄主的成虫寿命和产卵前期没有显著性差异,但成虫的产卵量、Vg及VgR表达量有显著差异。取食人工饲料的斜纹夜蛾产卵量最多,为(889±43.0)粒,其次为取食地瓜(496±53.1)粒、空心莲子草(362±37.3)粒,和甘蓝(193±9.7)粒。取食甘蓝、空心莲子草和地瓜的斜纹夜蛾雌虫卵巢Vg和VgR的相对表达量仅为取食人工饲料斜纹夜蛾的40%～80%,且取食不同寄主的斜纹夜蛾Vg和VgR的相对表达量与产卵量呈正相关关系。【结论】斜纹夜蛾取食不同寄主后,其卵巢内的Vg和VgR表达量存在差异,从而影响到斜纹夜蛾卵子发育,最终造成其生殖力存在差异。     

黄曲条跳甲RCN基因的克隆与表达

【目的】克隆黄曲条跳甲钙离子结合蛋白（reticulocalbin, RCN）,并分析其序列特征和表达谱。【方法】结合转录组测序及荧光定量PCR技术,鉴定和分析黄曲条跳甲钙离子结合蛋白基因的序列特征、功能及表达谱。【结果】获得的黄曲条跳甲RCN基因的cDNA序列全长为1 197 bp,开放阅读框为984 bp,共编码327个氨基酸残基。其蛋白分子含有5个亮氨酸拉链结构域（EF-hand）,与钙离子结合的模体可能为DX（N/D）X（D/N）XXXXXXE。cDNA序列的系统发育分析表明,黄曲条跳甲的RCN与赤拟谷盗的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,RCN在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位都有表达,具有一定的广谱性,其中在头部和中肠的表达量相对较高;触角中雌虫的相对表达量是雄虫的1.9倍,而在生殖系统中,雄虫的相对表达量是雌虫的2.1倍。【结论】成功鉴定了黄曲条跳甲的一种钙离子结合蛋白基因,初步分析了该基因与钙离子结合的模体序列及在虫体不同部位转录水平的表达情况。     

绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素（20E）对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数（发育历期、若虫体重及成虫羽化率）的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2 715 bp,开放阅读框2 106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区（RGS,54—175 aa）、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（S-TKc,191—454 aa）、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分（S-TK-X,455—534 aa）和PH结构域（PH,558—655 aa）,其中PH结构域是GRK2蛋白的典型结构域;系统发育分析结果表明,绿盲蝽GRK2与茶翅蝽GRK2亲缘关系最近;AlGRK2在绿盲蝽1—16日龄虫体内均有表达,mRNA表达量呈现出波动式下降的模式,在绿盲蝽初始龄期的表达量较高,而在末龄期的表达量显著下降;AlGRK2在绿盲蝽雌成虫卵巢和脂肪体中高表达,在胸与足中的表达量较低;外源20E处理后,AlGRK2在绿盲蝽1日龄和3日龄表达量显著下调,AlGRK2在雌成虫各组织中均表达上调,在卵巢及脂肪体中上调幅度最大,相反的是,20E信号通路中PLC抑制剂U73122处理的AlGRK2表达量下调;绿盲蝽若虫发育历期、末龄若虫体重和成虫羽化率均显著下降,相反的是,U73122处理组若虫期的发育历期显著延长;此外,与注射dsGFP处理组相比,注射dsAlGRK2处理后绿盲蝽的AlGRK2表达水平显著下降,若虫死亡率及发育历期显著增加,而成虫羽化率和5龄若虫体重均显著下降。【结论】AlGRK2在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;外源20E抑制剂及RNAi处理后,均可抑制AlGRK2的表达,同时还可对绿盲蝽生长发育产生不利影响,表现为延缓绿盲蝽的发育进度、降低5龄若虫体重及成虫羽化率。     

日本血吸虫SjELAV-like 1的克隆、表达及功能分析

【目的】克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（SjELAV-like 1）,分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位,探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。【方法】利用RACE技术扩增5′/3′末端,获得SjELAV-like 1基因序列提交至NCBI,Gene Bank登录号：MG515727,构建该序列的重组表达质粒 pET28-SjELAV-like 1,并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达,收集不同诱导时间的菌体,SDS-PAGE法进行蛋白电泳。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白,用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用于Western blotting 分析虫体内该天然蛋白的免疫原性,以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴,收集虫体不同发育阶段混合和合抱分开的雌、雄虫体,以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体,通过实时定量 PCR分析该基因的表达情况。通过尾静脉注射小干扰RNA（siRNA）于感染小鼠体内,使该基因表达沉默,筛选最佳干扰效果的siRNA,用于长期RNA干扰（RNAi）试验,分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响。利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响。【结果】获得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾,其中编码序列为1 533 bp,编码510个氨基酸。重组质粒pET28-SjELAV-like 1在诱导4 h时表达量最高,主要以包涵体的形式存在,利用纯化蛋白获得了优质多抗,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性,经分析发现SjELAV-like 1蛋白主要分布在虫体体被。RT-qPCR 发现SjELAV-like 1在不同时期雌、雄虫体内均有表达,在雄虫体内表达稳定,但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势;在不同感染状态的雌、雄虫体内,与正常发育雌虫相比,该基因在发育阻遏雌虫体内高表达,而在雄虫体内无明显差异。RNAi试验中,与NC组相比,长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27%（P＜0.05）、40.59%（P＜0.01）和74.58%（P＜0.01）;电镜观察发现,干扰组虫体体被结构改变,雄虫体表粘附的泡状物消失,立体的褶脊结构塌陷,整齐排列的条索状皮脊变的疏松,网状结构消失,雌虫体壁表面组织间隙增宽,分布于其上的体棘减少、变钝,雄虫精母细胞数目减少,其内的染色质减少,细胞肿大,细胞间质增宽,雌虫卵黄细胞中卵黄球减少,其中包含的卵黄滴也减少,内质网肿大,皮质颗粒排列散乱。【结论】成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列,且发现该基因主要在虫体体被表达。该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显著降低,并改变虫体体被结构,抑制生殖腺的正常发育,提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用。     

甜菜夜蛾触角气味受体基因OR18的克隆和表达定位

【目的】从甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）成虫触角中克隆气味受体基因,研究受体基因在虫体不同组织和触角不同感受器中的表达分布,从而探讨受体基因的功能。【方法】通过PCR结合RACE技术克隆气味受体基因的全长序列,利用实时定量PCR检测其在不同组织中的表达,采用原位杂交确定其在触角不同感受器中的分布。【结果】通过同源克隆的方法从甜菜夜蛾触角中获得1条740 bp的基因片段,通过RACE技术获得全长序列并命名为SexiOR18（GenBank登录号JN873314）。SexiOR18 cDNA全长1 618 bp,开放阅读框长度为1 194 bp,编码398个氨基酸。序列比对和进化树分析结果显示SexiOR18与其它鳞翅目昆虫尤其是夜蛾科昆虫的OR18具有很高的相似性。实时定量PCR检测结果显示,SexiOR18主要在成虫触角中表达,且在雌虫中的表达量显著高于雄虫,SexiOR18在成虫其它组织和幼虫触角中无明显表达。原位杂交结果显示,SexiOR18主要在毛形感器和锥形感器下表达,而在腔锥形感器和刺形感器下没有表达。【结论】SexiOR18在感受性信息素和普通气味的毛型感器和锥形感器中都有分布,推测其可能参与了性信息素和普通气味分子的识别。     

蠋蝽生殖器及胸足化学感受器的显微结构观察

【目的】蠋蝽是一种重要的捕食性天敌昆虫,观察其生殖器及胸足感受器类型及其形态特征,有助于探究其寄主选择等行为的机理。【方法】采用扫描电镜对蠋蝽生殖器及胸足感受器类型及其形态进行观察。【结果】蠋蝽雄虫交配器和雌虫产卵器上的感受器均有4种,分别为毛形感受器、刺形感受器、腔锥形感受器和锥形感受器,但雌虫产卵器上的刺形感受器和毛形感受器长度长于雄虫交配器;雌虫和雄虫胸足上的感受器有5种,分别为毛形感受器、刺形感受器、腔锥形感受器、锥形感受器以及B?hm氏鬃毛感受器,但雌雄虫胸足上的感受器大小存在一定差异:雌虫中后足上的刺形感受器长度长于雄虫,雌虫后足上的毛形感受器(Ⅰ型和Ⅱ型)长度长于雄虫,雄虫前足上的B?hm氏鬃毛感受器长度长于雌虫。【结论】蠋蝽生殖器和胸足上都存在多种类型的感受器,其形态和种类差异不大,仅部分感受器大小存在差异。     

绿盲蝽卵黄原蛋白(Vg)基因片段克隆及不同生境表达量分析

为了探讨不同果园生境对绿盲蝽生殖的影响,从分子角度确定绿盲蝽适合的产卵生境,本研究首先采用绿盲蝽专用诱芯调查了枣园、葡萄园的绿盲蝽发生量,然后通过比较半翅目,直翅目,膜翅目,鳞翅目等昆虫cDNA同源序列,根据基因保守序列设计一对简并性引物,克隆绿盲蝽卵黄原蛋白(Vg)基因片段,采用RT-PCR的方法检测了2种生境中Vg基因相对表达量。结果显示,枣园绿盲蝽的发生量始终高于葡萄园,枣园有4个发生高峰,而葡萄园有2个。基因克隆获得一段大小为732 bp的基因片段,编码244个氨基酸;该基因序列与其他蝽类昆虫Vg基因氨基酸序列的同源性达80%以上;系统进化分析表明,绿盲蝽Vg基因与赤须盲蝽、烟盲蝽及黑肩绿盲蝽的亲缘关系最近,克隆的基因片段为绿盲蝽Vg基因片段,并命名为AL-Vg。不同生境Vg基因表达量比较可知,枣园的表达量低于葡萄园,结合发生量表明枣园生境更适合绿盲蝽生殖产卵。     

长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP1克隆和表达分析

【目的】克隆和表达长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti Guerin-Meneville信息素结合蛋白基因并进行基因序列和表达分析,为进一步研究该基因的生理功能奠定基础。【方法】通过RT-PCR技术克隆了信息素结合蛋白基因,采用生物信息方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR技术研究其在长足大竹象不同虫态和不同组织中的表达量。【结果】克隆获得长足大竹象信息素结合蛋白基因,命名为Cbuq PBP1(Gen Bank登录号:KU845733.1),开放阅读框为432bp,编码143个氨基酸残基,分子量为15.84 k D,等电点为4.60,含6个保守半胱氨酸位点。系统进化树结果显示,Cbuq PBP1与其他昆虫PBP具有较高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,Cbuq PBP1在雄虫、雌虫、幼虫体内均有表达,但在雄虫体内表达量最高(P0.05)。同时,在雄虫触角中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。【结论】表明Cbuq PBP1在长足大竹象不同虫态和不同组织中差异表达。     

扶桑绵粉蚧环指蛋白基因的克隆及其序列特征与表达谱分析

【目的】克隆我国重要入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)环指蛋白基因(PsRing3)序列,分析其序列特征与表达谱,为进一步揭示扶桑绵粉蚧环指蛋白基因的生理功能提供参考。【方法】用RACE方法克隆扶桑绵粉蚧环指蛋白基因,用生物信息学方法对其编码蛋白进行结构和系统进化分析,用实时荧光PCR方法研究其在各个虫态(卵期及1龄、2龄、3龄若虫和成熟雌虫)中的表达差异。【结果】克隆的扶桑绵粉蚧环指蛋白基因的开放阅读框包含678bp的片段,编码225个氨基酸。多序列比对表明该蛋白非常保守。系统进化树分析表明,扶桑绵粉蚧与半翅目的豆无网长管蚜(Acyrthosiphon pisum)聚为一支,然后与人体虱(Pediculus humanus corporis)相聚。环指蛋白基因在扶桑绵粉蚧各个虫态均有表达,但以卵期最高,1龄、2龄若虫和成熟雌虫表达量相当。【结论】成功克隆了扶桑绵粉蚧环指蛋白基因,其在不同虫态中的差异表达为进一步揭示该基因在虫体中的生理功能奠定了基础。     

烟夜蛾气味受体OR18基因克隆及组织特异性表达

应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术,从烟夜蛾雄虫触角中克隆气味受体目的基因,分析鉴定了其在烟夜蛾不同组织的特异性表达情况.序列分析结果表明,目的基因为新的烟夜蛾气味受体基因,命名为HassOR18(GenBank登录号:HM750915).该基因阅读框架全长1 197 bp,编码398个氨基酸,推测编码蛋白质的相对分子质量为46.6 kD,等电点为5.82.氨基酸序列比对表明,烟夜蛾气味受体HassOR18与其他夜蛾科昆虫OR18的氨基酸序列一致性均达80％以上.实时荧光定量PCR结果显示,HassOR18仅在雌雄虫触角中和雌虫喙内表达,而且在雄虫触角内的表达量远高于在雌虫触角和喙内的表达量,推测该基因可能参与性信息素的识别.     

绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1的克隆、表达谱分析及结合特征

 【目的】克隆、组织特异性表达以及荧光结合特征分析绿盲蝽 (Apolygus lucorum Meyer-Dür)化学感受蛋白（chemosensory protein,CSP）。【方法】设计特异性引物,用RT-PCR技术克隆绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,使用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术对AlucCSP1组织特异性表达进行研究,在BL2（DE3）工程菌株中用pGEX-4T-1载体进行原核表达,并在GSTrap FF柱中纯化和去标签蛋白。使用bis-ANS作为荧光配基,研究AlucCSP1蛋白与58种气味标样和5种棉花次生代谢物质的结合特征。【结果】得到了绿盲蝽化学感受蛋白基因,命名为AlucCSP1（GenBank登录号：JN573217）。该序列阅读框全长393 bp,编码130个氨基酸残基,N端有一段长17个aa的信号肽,具有4个保守的半胱氨酸残基。绿盲蝽AlucCSP1几乎全部在雌虫触角中表达。构建pGEX/AlucCSP1原核表达载体,在BL21（DE3）工程菌株中表达出分子量约为39 kD的融合蛋白,用亲和层析法纯化、经凝血酶作用去除标签蛋白获得纯化的AlucCSP1蛋白,该蛋白与棉酚、单宁、槲皮素、芦丁水合物亲和力较强,结合常数分别为13.4、32.7、19.7、38.5 μmol•L-1。【结论】克隆得到绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,在雌性触角内特异表达,并进一步得到约13 kD的AlucCSP1纯蛋白。为研究AlucCSP1在绿盲蝽化学感器中的作用奠定了基础。     

骆驼斯氏副柔线虫雌虫和雄虫比较转录组学分析

为探明骆驼斯氏副柔线虫雌虫和雄虫的转录组差异,挖掘出与性别决定相关的功能基因,采用Illumina HiSeqTM2000分别对其雌虫和雄虫样本进行转录组测序,构建cDNA文库,通过建库质量评估和组装效率评估后对其进行功能注释及相关生物信息学分析。结果显示,比较雌虫和雄虫的转录本,获得6 430个差异表达基因,其中2 131个基因上调;4 299个基因下调。对差异表达基因进行GO功能分类,有341 328和714个Unigenes分别注释到生物学过程、细胞组成和分子功能三大类41个分支中。KEGG数据库分析,有1 116个差异表达基因参与到198条KEGG通路中,显著富集在机体免疫调节,卵母细胞成熟等通路。功能聚类分析中,雌虫样本在生殖发育、产卵、生殖行为中高表达;雄虫在主要精子蛋白、丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶中高表达。此外,在雄虫和雌虫中筛选出Tab-3,Tab-5、Fem-1和Mog-3等10种线虫性别决定相关基因,以及8种雄性性别特异表达基因和4种雌性性别特异表达基因,这些基因在虫体性别决定和性别特异性表达中发挥重要作用。本研究利用生物信息学技术预测出雌虫和雄虫差异表达基因在功能分类和代谢通路等方面的生物学特征,挖掘出性别决定基因和性别特异性表达相关基因,为进一步开展斯氏副柔线虫的功能基因组学研究、药物靶点预测和疫苗候选基因筛选提供有价值的数据资源。     

UV照射对棉铃虫产卵量及HMG-CoA还原酶和卵黄原蛋白基因表达量的影响

检测紫外光(ultra violet,UV)照射后棉铃虫HMG-CoA还原酶基因、卵黄原蛋白基因的表达量及棉铃虫产卵量的变化。提取经UV照射后棉铃虫雌虫的总RNA并反转录为cDNA。利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测HMG-CoA还原酶基因及卵黄原蛋白基因的表达量。UV照射后,统计棉铃虫雌虫的产卵量。结果表明:UV照射0.5~5.0 h,棉铃虫HMG-CoA还原酶基因的表达量显著增加;UV照射1.0~5.0 h,24 h后取样发现棉铃虫卵黄原蛋白基因的表达量显著增加;UV照射1.0~4.0 h,棉铃虫雌虫的产卵量显著增加。研究结果证实UV照射能影响棉铃虫hmgr、vg的表达量和雌虫的产卵量。