陕北地区马铃薯X病毒CP基因的RT-PCR检测及其序列分析

【目的】分析陕北8个县(区)马铃薯X病毒外壳蛋白(CP)基因序列的一致性和变异性,明确病毒变异程度,为脱毒马铃薯的推广提供参考。【方法】以陕北8个县（区）种植2～3代疑似携带病毒的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取8个采样点马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯X病毒CP基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后对CP基因进行克隆并测序,使用DNAstar软件分析陕北马铃薯X病毒CP基因序列的一致性,并与国内外其他地区12个马铃薯X病毒进行比较,采用邻接法构建系统进化树。【结果】从陕北8个县（区）马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的长度为620 bp目的片段,可知这些马铃薯均感染了X病毒。不同CP基因序列之间存在微小变异,8个县(区)样品间CP基因的序列一致性在95.2%～99.4%,与国内外其他地区12个样品CP基因的序列一致性在92.9%～98.5%。系统进化树显示,将X病毒可分为4个类群,而陕北8县(区) 马铃薯X病毒归属于其中的2个类群。【结论】马铃薯X病毒在陕北地区普遍存在,RT-PCR方法可快速、准确地检测到马铃薯X病毒,X病毒CP基因存在一定程度的变异。     

陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕北8个县(区)种植2~3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,对CP基因进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列的一致性。结果表明,从陕北8个县(区)马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致、长度为336 bp的目的片段,说明马铃薯均感染了卷叶病毒。陕北8个县(区)马铃薯卷叶病毒CP基因之间的序列一致性达99.6%以上,与国内外其他地区10个样品CP基因的序列一致性为96.2%~99.8%,表明马铃薯卷叶病毒的CP基因序列比较保守。     

马铃薯Y病毒黑龙江分离株外壳蛋白基因克隆及序列分析

为研究马铃薯Y病毒的检测方法,参考GenBank中马铃薯Y病毒的全基因序列,应用Primer 6.0引物软件设计并合成了一对特异性引物PVYF、PVYR,利用RT-PCR方法对PVY病毒黑龙江分离株CP基因进行特异性扩增,对扩增片段进行序列测定并进行序列比对。结果表明:引物PVYF、PVYR可以扩增出包含PVY病毒CP基因全长的cDNA特异性片段,序列分析结果表明PVY病毒黑龙江分离株CP基因与GenBank上的40个不同PVY病毒分离株的CP基因氨基酸序列同源性为92.1%~97.4%,说明PVY病毒CP基因保守性较高,可以用作制备PVY病毒血清型检测方法的抗体基因。     

山西省马铃薯Y病毒cp基因的克隆

[目的]对山西省马铃薯Y病毒cp基因进行克隆与序列特征分析。[方法]依据马铃薯Y病毒基因组序列，设计合成了一对引物PVYP1和PVYP2，以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板，对RT-PCR扩增得到的基因片段进行序列测定。[结果]该DNA片段1～798bp为马铃薯Y病毒印基因，799～1064bp为3’非编码区序列，可编码265个氨基酸。将RT—PCR产物与载体连接后转入大肠杆菌提取阳性克隆的质粒DNA，酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，重组质粒已转入大肠杆菌。BLAST软件分析表明，山西省马铃薯Y病毒分离物CP氨基酸序列与已公布的PVY CP氨基酸序列相似性最高可达100％，说明所得DNA片段确为PVY cp基因片段。[结论]该研究为对山西省马铃薯Y病毒的防治提供理论依据。     

河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物,以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系p1基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY p1基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。     

山西省马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了1对引物,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到852 bp的基因片段并进行了序列测定。BLAST分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系pl基因序列相似性最高可达99%。     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

榆林地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕西省榆林地区种植2~3代的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成一对特异引物,反转录合成cDNA,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后回收纯化扩增产物并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。电泳结果表明,在榆林地区的马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的目的片段,说明这些马铃薯均感染了PSTVd;序列分析表明,10个不同采样点PSTVd的目的片段大小为250~251 bp,只是单个碱基之间的转换或缺失,PSTVd在榆林地区几乎没有发生变异,与国内外其他15个地区已报道的序列一致性在82.3%~99.5%之间。     

马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测

病毒是马铃薯生产过程中危害较大的一类病原,为快速检测出云南省马铃薯主要病毒种类,依据病毒外壳蛋白基因序列设计合成了马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)的特异性引物,从退火温度、最低检测浓度、热反应循环条件、病毒间的模板及引物间的最佳组合浓度进行优化,建立了三重RT-PCR反应体系。结果表明:该优化体系可同步扩增出上述3种病毒,分别得到480 bp(PVY)、187 bp(PVS)、336 bp(PLRV)大小的扩增片段。优化的三重RT-PCR反应体系可快速、灵敏、简便的检测到单一或复合侵染的马铃薯病毒,有利于马铃薯病毒病的早期检测和防治,将为云南省马铃薯种苗脱毒、继代、田间植株的高产栽培等有重要实践作用。     

甘蔗黄叶病毒的RT-PCR检测技术

以甘蔗黄叶病毒(ScYLV)特异性引物YLSF111和YLSR462为引物,对福建蔗区8个罹病品种的疑似病株进行RT-PCR检测,扩增出352 bp特异性片段.将PCR产物克隆后测序,序列分析表明,该片段是ScYLV外壳蛋白(CP)基因的一部分,核苷酸和氨基酸序列同源性达95%以上,与美国、印度、巴西等国家ScYLV分离物(GeneBank登录号分别为AF157029、AY236971、AF141385)CP基因同源性达100%,证实我国福建地区甘蔗黄叶综合症的病原体为ScYLV.本研究同时建立了ScYLV的RT-PCR检测技术.     

侵染荷兰郁金香的郁金香碎色病毒和黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测

以从荷兰引进的4个郁金香品种病株为材料,利用马铃薯Y病毒的简并引物和黄瓜花叶病毒CP基因的一对特异引物,通过RT-PCR技术分别扩增出与预期大小相一致的1 800 bp和840 bp左右的片段,而对照无任何产物.感受态转化后,进行测序,结果表明田野、多道多、雪莉和克思尼4个品种中均能检测到郁金香碎色病毒和黄瓜花叶病毒.     

马铃薯Y病毒的RT—PCR检测

通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA,然后针对PVY~N的CP基因序列,设计合成了一对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增,结果得到与预期大小相一致的780bp片段,而对照未得到任何产物,从而建立了运用RT－PCR手段检测植物中PVY的又一有效途径,并运用此方法对东北三省部分地区马铃薯种薯中PVY的带毒情况进行了检测。     

青海省部分地区马铃薯Y病毒cp基因序列分析

马铃薯Y病毒(PVY)是危害我国马铃薯的主要病毒之一,其在自然条件下极易发生基因变异而产生株系分化现象。为揭示青海马铃薯Y病毒分离物cp基因的分子变异,利用RT-PCR方法扩增获得了16个马铃薯Y病毒分离物的cp基因序列,采用SDT、DANMAN、RDP和MEGA软件对其进行分子变异分析。序列一致率结果表明,16个分离物的核苷酸序列均为801个碱基,一致率为98.0%~100%,编码267个氨基酸,一致率为94.8%~100%。重组分析表明,16个分离物未发生基因重组。系统发育分析发现,11个分离物与PVY^N-Wi株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近,占被检出病毒分离物的68.7%;另外5个分离物与PVY^O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^O株系亲缘关系最近;未发现PVY^C株系、PVY^N株系、PVY^E株系和PVY^NTN株系存在。     

马铃薯病毒疫情调查及马铃薯S病毒的检测鉴定

[目的]了解河北省张家口市马铃薯病毒病害发生情况并对马铃薯S病毒（PVS）进行鉴定。[方法]对采自河北省张家口市的46份马铃薯样品进行生物学测定和血清学及分子生物学检测。[结果]46份样品中有35份为马铃薯Y病毒（PVY）侵染，其中有6份是PVY与PVS混合侵染，其余29份为PVY单独侵染。用特异性引物扩增PVS外壳蛋白基因的部分序列，获得685bp的目的产物，该序列与已报道的PVS核苷酸序列同源性在80％以上，编码227个氨基酸，与已报道的PVS外壳蛋白的氨基酸同源性均在90％以上。证明该样品中确实携带PVS。[结论]该研究为今后该地区马铃薯病毒病害的控制及防治提供了依据。     

李属坏死环斑病毒（PNRSV）RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒（PNRSV）外壳蛋白（CP）基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增（LAMP）引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV）的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。     

荧光RT-PCR法快速检测微量建兰花叶病毒研究

根据基因库中建兰花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列,设计并合成3对特异性引物,利用荧光RT-PCR方法在蜘蛛兰中检测到普通RT-PCR-琼脂糖电泳法检测不到的微量病毒。熔解曲线分析表明,每一扩增产物为单一产物形态。通过测序和同源性分析,试验证实扩增产物序列的实际长度与预期完全相符,蜘蛛兰样品的扩增产物基因序列与基因库中建兰花叶病毒相应序列的同源性为94%～96%。与普通RT-PCR的相比,荧光RT-PCR方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点,可应用于种苗中微量建兰花叶病毒的早期检测。     

云南马铃薯A病毒分布及其外壳蛋白分子变异分析

为研究云南马铃薯A病毒(PVA)分布及其外壳蛋白的分子变异,2007年至2011年分别从云南滇西北、滇东北、滇中及滇南马铃薯种植区采集381份马铃薯样品,进行马铃薯A病毒DAS-ELISA检测,结果表明,PVA阳性样品共43份,其中滇西北22份,滇中17份,滇东北4份,滇南未检出。对带有PVA的部分样品进行电镜负染色观察,电镜下观察到长约750 nm、直径约15 nm的线状粒子。根据已报道的PVA外壳蛋白基因(cp基因)序列设计合成特异性引物,以带毒样品总RNA为模板,RT-PCR扩增得到807 bp目的片段,克隆测序并对其推导的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行同源性分析,并比较分析了不同地区PVA分离物CP氨基酸序列分子变异。结果表明,云南不同地区PVA分离物与GenBank中登录的部分PVA分离物CP氨基酸序列同源性为93.3%～100%,依据不同PVA分离物CP氨基酸序列构建系统进化树,云南PVA分离物与中国福建分离物(AF483279)亲缘关系较近,形成一个进化簇。PVA不同分离物CP氨基酸序列分子变异分析表明,不同分离物CP氨基酸变异位点主要分布在氨基酸序列的N端。