T1083替换融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母的自激活试验（摘要）（英文）

[目的]研究T1083替换融合质粒载体pGBKT7-Ts转入酵母的自激活实验,探讨其表达产物是否可作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[方法]将T1083替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母后,进行自激活和蛋白表达毒性检测试验。pGBKT7-TS对报告基因自主激活的检测。将pGBKT7-TS质粒转染S.cerevisiae strainAH109和S.cerevisiaeY187菌株,同时分别转入pGBKT7作为对照,在SD-Trp平板上挑取转化菌落,悬于适量无菌水中,再分别接种于SD-Trp ＋X-α-gal、SD-Trp-His ＋X-α-gal、SD-Trp-Ade ＋X-α-gal和SD-Trp-Ade-His ＋X-α-gal平板。30℃培养2 ～3 d,观察各平板菌落颜色。确定含有pGBKT7-TS质粒的AH109和Y187酵母细胞内HIS、ADE、Mel1、LacZ报告基因的表达情况。pGBKT7-TS对酵母AH109和Y187的毒性检测、挑取大于2 mm的pGBKT7-TS转化的AH109克隆和pGBKT7-TS转化的Y187克隆各1个,分别接种于50 ml SD/-Trp＋Kan（20μg/ml）培养基中,30℃、250 r/min培养16 h,检测OD600,若OD600〈0.8,则DNA-BD可能有毒性;若OD600≥0.8,说明DNA-BD无毒性。[结果]转化pGBKT7-TS的酵母菌AH109在SD-Trp ＋X-α-gal平板和SD-Trp-His ＋X-α-gal平板上均可长出菌落,但在SD-Trp-Ade ＋X-α-gal平板和SD-Trp-Ade-His＋X-α-gal平板上均无菌落生长,表明转入pGBKT7-TS后His报告基因有泄漏表达,但不能激活ADE和MELI报告基因。毒性检测试验中,重复2次,其OD600均大于0.8,说明DNA-BD融合蛋白对酵母AH109和Y187的生长无毒性,可以作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了试验基础。     

T1083替换NtKRP尾部BD融合载体pGBKT7-TS的构建（摘要）（英文）

[目的]扩增烟草NtKRP基因尾部含T1083替换的片段,将其克隆入pGBKT7载体中。[方法]以pBI121KE质粒为模板进行PCR反应,将得到的PCR产物凝胶回收后等摩尔混合,取适量作为模板,得到含定点突变的尾部片段。将该PCR产物克隆入SmaI线性化的pUC19载体,构建含T1083替换的重组子pUC19Ts。通过蓝白斑筛选得到的重组子进行BamHI -SmaI双酶切鉴定,将筛选出的正确重组子送交联合基因测序。将pGBKT7和测序正确的pUC19Ts质粒均用BamHI -SmaI双酶切,分别回收1 320 bp的融合片段和7.3 kb的载体片段进行连接,转化并筛选得到重组子,任意挑取2个单菌培养后提取质粒进行BamHI -SmaI双酶切鉴定。[结果]成功构建了NtKRP尾部含T1083替换的BD融合质粒载体pGBKT7-TS。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了实验基础。     

T1083替换NtKRP尾部BD融合载体pGBKT7-Ts的构建

[目的]构建T1083替换NtKRP尾部BD融合载体pGBKT7-Ts。[方法]以pBI121KE质粒为模板,通过重叠PCR扩增烟草NtKRP基因尾部含T1083替换的片段,将其克隆入pGBKT7载体。[结果]成功构建了T1083替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-Ts。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了实验基础。     

eSRKs酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础.     

蓖麻毒素B链(RTB)酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

采用PCR技术扩增蓖麻毒素B链基因,并克隆入诱饵载体pSos中,成功地构建了酵母双杂交诱饵载体pSos-RTB。将重组质粒与对照质粒共转化入酵母菌cdc25H。结果表明:该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25H无毒性和无自激活作用,且在酵母细胞中定位正确。     

玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

玉米中ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力,然而截至目前对其潜在的分子机制却知之甚少。为构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性,利用gateway技术,以实验室保存的重组质粒pMD19T-ZmMPK5为模板,扩增得到带有attB位点的ZmMPK5基因的ORF片段,通过BP重组反应和LR重组反应,最终将该片段构建到诱饵表达空载体pDEST32上,PCR及测序鉴定结果表明,成功构建了阅读框方向和序列均正确的重组诱饵载体pDEST32-ZmMPK5。用PEG/LiAc法将重组诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5转化酵母菌株MaV203感受态细胞,通过缺陷型平板表型分析以及X-gal分析实验检测诱饵载体表达的蛋白对宿主细胞是否具有毒性和自激活作用。最终结果表明构建的诱饵载体对宿主酵母菌MaV203既无毒性也无自激活活性,可用于后续研究,为进一步利用酵母双杂交方法从玉米cDNA文库中筛选与ZmMPK5相互作用蛋白奠定了基础。     

朊蛋白(prp23-231)酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

PCR扩增小鼠朊蛋白（prp23-231）基因,克隆入诱饵载体psos,将重组质粒与对照质粒共转化酵母菌cdc25H,成功地构建了小鼠朊蛋白（prp23-231）酵母双杂交诱饵载体pSos-prp23～231,并证实该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25H既无毒性,也没有自激活作用。     

Lescpth5诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

[目的]构建诱饵载体pGBKT7-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性。[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测。[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确。自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用。[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cD-NA文库筛选奠定基础。     

同源重组快速构建甘蓝SCR 酵母双杂交诱饵载体及其自激活作用的检测

采用巢式PCR获得甘蓝SCR的成熟肽编码区,利用同源重组技术首次将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-SCR,结果表明:通过巢式PCR获得了正确的甘蓝SCR成熟肽编码区,并成功构建到pGBKT7诱饵载体中,且转化有诱饵载体的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,而在SD/-His-Trp和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷平板上皆不能生长,说明对报告基因无自激活作用;且毒性实验也表明,SCR蛋白对酵母没有毒害作用.     

拟南芥AtGRP7基因诱饵载体的构建及酵母双杂的初筛

AtCRPI基因是拟南芥的一个从动振荡器基因,目前其生理功能知之甚少。为了更好地研究与AtCRP7基因的互作蛋白,笔者利用PCR技术从携带AtGRP7基因序列的质粒中扩增该基因的编码序列,然后将目标序列插入pGBKT7载体的NcoⅠ和PstⅠ2个酶切位点之间,构成酵母双杂体系的诱饵载体。酶切和测序结果表明,构建的载体目标基因序列和阅读框是正确的。之后,将该载体转入感受态酵母Y2HGold菌株中,并检测其表达物对报告基因的激活情况。AtGRP7酵母转化菌在SD／-Tip平板上长势良好;在SD／-Trp-Ade平板上长势较弱;在SD／-Trp／-His和SD／-Trp／-Ade／-His平板上则没有生长。这说明His合成相关基因没有被转录和翻译,AtGRP7基因在该酵母双杂体系中没有自转录激活。笔者在酵母双杂的初步筛选中,还获得几个可能与AtGRP7互作的基因。     

拟南芥NiNJA基因酵母双杂诱饵载体构建及互作蛋白的筛选

JAZ蛋白是植物茉莉酸信号途径的重要负调控因子,JAZ与NiNJA形成蛋白复合体抑制茉莉酸下游转录因子的转录活性,NiNJA蛋白是联系JAZ蛋白与下游转录因子的重要因子.为了研究NiNJA调控的下游基因,首先构建了NiNJA基因的诱饵载体pGBKT7-NiNJA,然后转化酵母Y2H Gold感受态,通过自转录激活实验,发现诱饵载体pGBKT7-NiNJA没有自转录激活活性.在此基础上,从拟南芥“Mate&PlateTM”Library 进行酵母双杂筛选,获得若干个与NiNJA互作的蛋白,为下一步鉴定NiNJA的互作蛋白及茉莉酸的信号调控途径打下基础.     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体的构建和鉴定

对小鼠朊蛋白（prp105—125缺失）的基因片段进行扩增,并将扩增片段导入诱饵载体pSos中构建酵母双杂交诱饵载体pSos-prp朊蛋白（prp105—125缺失）,用重组质粒转化感受态酵母菌cdc25H,检验其表达产物在酵母细胞中有无毒性及自激活作用。序列分析结果表明,该试验成功构建了小鼠朊蛋白（prp105-125缺失）酵母双杂交诱饵载体,且该诱饵质粒的表达产物对酵母菌cdc25H既无毒性也无自激活作用。     

小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定

以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25 d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白,以此来鉴定文库的有效性。结果表明：初级文库容量为1.82×10⁷ CFU/mL、次级文库的容量为1.91×10⁷ CFU/mL,文库重组率均大于 96%,插入片段平均长度在 1 000 bp 以上。酵母双杂交文库转化效率为1.97×10 CFU/μg,文库容量为2.04×10⁷ CFU/mL。构建诱饵载体pGBKT7-TaDAR1并转化Y2H酵母菌株,经检验存在自激活现象,进一步截断检测发现此蛋白N端无自激活,C端有自激活,以BD-TaDAR1-N为诱饵载体,筛选酵母文库,获得其互作蛋白序列,并命名为TaDAR1IP,经回转验证TaDAR1-N与TaDAR1IP存在相互作用关系。表明本试验方案构建的酵母文库是高质量的有效的。为初学者构建酵母双杂文库及使用“mating”法筛选酵母文库提供借鉴,也为后续小麦基因功能的研究奠定基础。     

稻瘟菌蛋白激发子在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1,并在其上下游分别引入酶切位点EcoRI和XhoI,经双酶切后与诱饵质粒载体pLexA连接构建重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,将该重组诱饵质粒转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中进行β-半乳糖苷酶整板分析检测自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为筛选番茄cDNA文库获得诱饵蛋白PemG1的相互作用蛋白奠定了基础。