巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

一种快速、特异性检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata）的巢式 PCR 方法

为建立检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata ）的方法,从河南省小麦黑胚籽粒上分离得到7个优势 A．alternata 病原菌株,对其 rDNA 的内部转录间隔区序列（ITS）进行测序,序列比较表明,分离到的病原菌株与 GenBank 公布的 A．alternata 的 ITS 区序列一致性达到99％～100％。根据 Alternaria 属菌株（A．alternata、A．tenuis、A．tenuissima）和麦类根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana ）的 ITS 序列比对结果,设计出1对 A．alternata 特异性引物 Aa1F/Aa1R。利用多种河南省小麦的主要病原真菌对该引物的特异性进行验证,只有在 A．alternata 中能特异性地扩增出1条443 bp 的 DNA 片段。以真菌通用引物 ITS1/ITS4为外侧引物、特异性引物Aa1F/Aa1R 为内侧引物进行巢式 PCR 扩增,能检测到 A．alternata DNA 的最低质量浓度为50 pg/μL。因此,建立的巢式 PCR 方法能够快速、特异地检测小麦中的 A．alternata。     

云杉叶疫病根球壳孢菌的分子检测

从四川二郎山人工云杉林分离得到云杉叶疫病病原菌,采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增得到的序列与NCBI中的根球壳孢菌(Rhizosphaera kalkhoffi)相似度达99%。比较分析了NCBI及四川二郎山分离到的根球壳孢菌ITS区序列,采用软件primer5.0设计20个引物。通过对32株菌株DNA进行PCR扩增及产物测序,筛选得到3个特异性引物对ZYZ6、ZYZ7、ZYZ8。改变DNA模板浓度进行扩增检测,在25μL PCR反应体系中,引物对ZYZ6F/ZYZ6R检测灵敏度最高,可达到0.1 pg/μL。利用ZYZ6F/ZYZ6R对四川二郎山人工云杉针叶DNA进行检测,扩增得到310 bp左右的条带,测序结果与Gen Bank中根球壳孢菌相似度达99%。     

不同产区麦冬、山麦冬rDNA-ITS序列分析

利用特异性引物进行PCR扩增和克隆、测定不同产区麦冬和山麦冬原植物的18S～26S r DNA-ITS区碱基序列,结果得到供试的7个不同产区麦冬和山麦冬植株样品rDNA的ITS及5.8S rDNA全序列、18S和26S rDNA部分序列,序列长度在696～711 bp.通过分析比较各ITS序列,表明不同产区麦冬和山麦冬rDNA-ITS区存在差异,可为其分子鉴别提供了依据.     

基于ITS序列的菟丝子PCR鉴定

提取了7个药用菟丝子种样品的DNA，采用ITS序列扩增通用引物对其进行PCR扩增，并对PCR产物进行克隆和测序．根据所测得菟丝子ITS全长序列与其常见易混品所在属的代表植物ITS序列比对，设计了一对特异性引物并进行了PCR检测．结果表明，此对引物能将药用菟丝子种子与4种易混品区分开来，可以用于药用菟丝子的真伪鉴定．     

几种槭属植物亲缘关系的ITS序列分析

为了选择适宜挪威槭"皇家红"嫁接的砧木,笔者对槭属植物的8个种(含变种)核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列进行了PCR扩增和序列分析,扩增出约750bp左右的的序列(包含完整的ITS1、5.8S和ITS2序列及部分18S和26S rRNA基因片段.各样品的ITS1长度为221～236bp,ITS2为231～237bp,含有多个特异性信息位点.并利用ITS序列为依据对8种槭属植物系统发育进行分析,从分子水平上阐明了8种槭属植物的亲缘关系,为挪威槭"皇家红"嫁接生产中适宜砧木的选择提供了理论依据.     

应用种特异性ITS引物(SS-ITS)鉴别新菠萝灰粉蚧

[目的]研究新菠萝灰粉蚧的种特异性ITS引物,以快速准确鉴定该虫,可为口岸快速通关提供依据.[方法]采用PCR扩增方法,首次测定分析了11种粉蚧39个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列.基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物,通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法.[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带,能有效扩增出约665 bp的DNA片段,其余种类均未有扩增条带.灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高,其检测限可达0.1 ng/μL.[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定,该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考.     

葡萄炭疽菌和辣椒炭疽菌rDNA—ITS区序列比较

采用植物病原真菌核糖体基因ITS区通用引物对葡萄炭疽病和辣椒炭疽病的病原菌进行扩增,分别获得相应序列。序列比较结果表明,两者该区的序列同源性达91．27％,ITS1和ITS2区均存在差异,但ITS2区差异更丰富。     

猪弓形虫特异PCR诊断方法的建立

[目的]建立特异PCR方法诊断猪弓形虫病.[方法]以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测.随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定.[结果]在猪弓形虫分离株中PCR扩增出目的条带,且在肺门淋巴结和肠系膜淋巴结中扩增出特异性条带;PCR方法能检测到的最低DNA量为7.81 pg/μL;测序结果显示核苷酸序列与Genbank中已登录的猪弓形虫IST1基因序列相应部分序列完全相同.[结论]该PCR方法具有较高的敏感性和特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法.     

贵州油茶软腐病病原检测

贵州是我国主要油茶种植省份之一,油茶种植爆发病虫害导致产量与质量急剧下降,其中软腐病最为显著。本文以油茶软腐病中的粉芽孢杆菌为例,结合实时荧光PCR和巢式PCR技术,检测油茶软腐病病原菌。荧光PCR检测过程为:设计反应程序与标准曲线,确定引物浓度、Mg~(2+)浓度,将油茶软腐病病原菌DNA作模板,通过特异性引物对L1/L2实现PCR扩增;在克隆质粒和病原菌XJ8-3-3悬液两种模板中,对比实时荧光PCR和普通PCR的灵敏度;向健康植株叶片注射软腐病粉芽孢杆菌悬液,培养5 d后,采集患病油茶植株根部、球茎等部位检测软腐病病原菌含量。巢式PCR检测病原菌过程为:菌株活化放置PDA平板培养两天并采集病原菌丝;根据油茶软腐病的ITS序列和GenBank中,近似种的ITS序列差异设计B1与B2两种特异性引物,经过预变性、变性等步骤完成扩增,扩增产物用于凝胶检测。检测结果如下:(1)两种模板环境下,实时荧光PCR检测灵敏度优于普通PCR技术100倍,叶柄组织的根部软腐病病原菌含量最少;(2)引物B1与B2检测油茶软腐病病菌得到405 bp左右的条带扩增产物,测序结果显示发病菌株的碱基序列和粉芽孢杆菌序列吻合。结果显示,两种PCR技术均可检测油茶软腐病病原中的粉芽孢杆菌,为防治油茶软腐病提供科学依据。